Kan damarları ve sinir lifleri yağ dokusu içinde Co boyama
Summary
Yeni kan damarı oluşumu ve sempatik innervasyon yağ dokusu remodeling içinde önemli rol oynarlar. Ancak, görselleştirme ve kantitatif yağ dokusu ölçme teknik sorunlar kalır. Burada başarılı bir şekilde etiketleyin ve kantitatif kan damarları ve sinir lifleri farklı yağ dokularında yoğunlukları karşılaştırmak için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Son yıllarda yapılan çalışmalarda kritik rolü anjiogenez ve yağ dokusu obezite gelişimi sırasında remodeling içinde sempatik innervasyon sermiştir. Bu nedenle, yağ dokusu dinamik değişiklikleri belgelemek için kolay ve etkin bir yöntem geliştirilmesi gereklidir. Burada, verimli bir şekilde kan damarları ve sinir lifleri yağ dokularında Co lekeleri değiştirilmiş bir immünfloresan yaklaşım tarif. Geleneksel ve son zamanlarda geliştirilen yöntemlerine göre bizim nispeten kolay takip etmek ve kan damarları ve sinir lifleri daha yüksek yoğunlukları ile ve daha az arka plan etiketleme daha etkili bir yaklaşımdır. Ayrıca, daha yüksek çözünürlük görüntülerin daha fazla doğru açık kaynak yazılım tarafından alan kaplar, dallanma miktarı ve elyaf uzunluğu ölçmek için bize izin verir. Bizim yöntemini kullanarak bir gösteri gösterdiğimiz o kahverengi yağ dokusundan (BAT) kan damarları ve sinir lifleri beyaz Yağ dokusundan (WAT) göre daha yüksek miktarda içerir. WATs arasında daha fazla kan damarları ve sinir lifleri epididimal WAT (eWAT) göre subkutan WAT (sWAT) olduğunu bulmak daha ayrıntılı. Bizim yöntem böylece yağ dokusu remodeling soruşturma için yararlı bir araç sağlar.
Introduction
Yağ dokusu tuşu metabolik ve endokrin1çalışır. Dinamik olarak genişletir veya daraltır yanıt olarak farklı besin2vurguluyor. Süreç modelleme etkin doku birden çok fizyolojik yolları/adımlardan oluşur anjiogenezi, fibrozis ve yerel inflamatuar microenvironments2,3,4şekillendirme dahil. Soğuk pozlama ve egzersiz, gibi bazı fiziksel uyaranlara sonuçta yeni kan damarı oluşumu ve yağ dokuları5,6sempatik innervasyon neden sempatik aktivasyon tetikleyebilir. Bu tadilat işlemleri sistemik metabolik sonuçları insülin duyarlılık, tip 2 diyabet2damgasını dahil olmak için sıkıca bağlıdır. Böylece, görsel olarak bu patolojik değişiklikler tüm yağ dokuları sağlıklı durumunu anlamak için çok önemlidir.
Angiogenez yeni kan damarı oluşumu sürecidir. Oksijen, besin, hormonlar ve büyüme faktörleri dokulara kan damarları sağlar beri angiogenez belgelenen farklı teknikler6,7ile, yağ dokusu remodeling içinde önemli bir adım olarak kabul edilmiştir 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. ancak, görüntülerin çözünürlüğünü, immunostaining ve damar yoğunluğu miktar için yöntemleri hakkında sorular kalır. Yeni kan damarı oluşumu için karşılaştırıldığında, innervasyon yağ dokusu içinde uzun bir süre için hafife. Son zamanlarda, Tang ve ark. kullanılan 14 intravital iki fotonlu mikroskobu gelişmiş ve adipositler tarafından sinir lifleri14katmanları çevrilidir gösterdi. O zamandan beri araştırmacılar sempatik innervasyon yağ dokusu Fizyoloji Yönetmelikte önemli rolü takdir başlamıştır. Bu nedenle, belge adipose sinir innervasyon için kolay ve pratik bir yaklaşım geliştirilmesi önemlidir.
Burada, kan damarları ve sinir lifleri bizim önceki protokollerine dayalı işbirliği boyama için en iyi duruma getirilmiş bir yöntem raporu. Bu yöntemle, kan damarları ve sinir lifleri gürültülü arka plan olmadan net görüntüler elde edebilirsiniz. Ayrıca, açık kaynak yazılım ile yoğunlukları nicel ölçüm gerçekleştirmek için yeterince yüksek bir çözünürlük elde edilir. Bu yeni yaklaşım kullanarak, biz başarıyla yapıları ve kan damarları ve sinir lifleri farklı yağ depoları içinde yoğunlukları karşılaştırabilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yağ dokusu remodeling için metabolik bozukluk doğrudan obezite geliştirme1,2sırasında bağlıdır. Angiogenez ve sempatik innervasyon dinamik remodeling işlemi2,12için temel etkilenebilir. Bu nedenle, yeni kan damarları gibi sinir lifleri görselleştirmek için uygun bir yaklaşım geliştirilmesi büyük önemi vardır. Önceki yöntemler angiogenez yağ dokusu içinde belgelenmesi için rapor …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada sağlık (NIH) hibe R01DK109001 (K.S.) Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
