Co Färbung Blutgefäße und Nervenfasern im Fettgewebe
Summary
New Schiff Blutbildung und sympathische Innervation spielen entscheidende Rolle im Fettgewebe, das umgestaltet. Es bleiben jedoch technische Probleme zu visualisieren und Fettgewebe quantitativ zu messen. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um erfolgreich zu kennzeichnen und quantitativ vergleichen die dichten der Blutgefäße und Nervenfasern in verschiedenen Fettgewebe.
Abstract
Neuere Studien haben deutlich gemacht, dass die kritische Rolle der Angiogenese und sympathische Innervation im Fettgewebe Umbau bei der Entwicklung von Fettleibigkeit. Daher ist es notwendig, eine einfache und effiziente Methode, um die dynamischen Veränderungen im Fettgewebe dokumentieren zu entwickeln. Hier beschreiben wir einen modifizierten immunofluorescent Ansatz, der effizient Blutgefäße und Nervenfasern in Fettgewebe Co Flecken. Im Vergleich zu traditionellen und neu entwickelte Methoden, ist unser Ansatz relativ einfach zu folgen und effizienter bei der Kennzeichnung der Blutgefäße und Nervenfasern mit höherer Dichte und weniger Hintergrund. Darüber hinaus ermöglicht die höhere Auflösung der Bilder weiter Bereich der Schiffe, die Höhe der Verzweigung und die Länge der Fasern durch open-Source-Software genau zu messen. Als eine Demonstration, die mit unserer Methode zeigen wir, dass diese braune Fettgewebe (BAT) höhere Mengen an Blutgefäßen und Nervenfasern im Vergleich zu weißen Fettgewebe (WAT) enthält. Wir ferner feststellen, dass unter die WATs, subkutane WAT (sWAT) mehr Blutgefäße und Nervenfasern im Vergleich zu epididymal WAT (eWAT) hat. Unsere Methode bietet somit ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Fettgewebe umgestaltet.
Introduction
Fettgewebe hat Schlüssel metabolische und endokrine Funktionen1. Es dynamisch erweitert oder verkleinert als Reaktion auf verschiedene Nährstoff betont2. Das aktive Gewebe Umbau Prozess besteht aus mehreren physiologischen Wege/Schritte einschließlich der Angiogenese, Fibrose und Gestaltung der lokalen entzündlichen Mikroumgebungen2,3,4. Einige körperliche Reize, wie kalte Belichtung und Übung können sympathische Aktivierung auslösen, führt letztlich zu neuen Schiff Blutbildung und sympathische Innervation im Fettgewebe5,6. Diese Umgestaltung Prozesse sind systemische metabolische Ergebnisse einschließlich Insulin-Empfindlichkeit, das Markenzeichen des Typ 2 Diabetes2eng verbunden. Visualisierung dieser pathologischen Veränderungen sind deshalb sehr wichtig für das Verständnis des gesunden Status des gesamten Fettgewebe.
Angiogenese ist der Prozess des neuen Schiffes Blutbildung. Da Blutgefäße Sauerstoff, Nährstoffe, Hormone und Wachstumsfaktoren Gewebe liefern, Angiogenese einen wichtigen Schritt im Fettgewebe, das umgestaltet, galt die mit verschiedenen Techniken6,7, dokumentiert ist 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. jedoch bleiben Fragen über die Auflösung der Bilder, die Effizienz der Immunostaining und Methoden zur Quantifizierung des Schiffes Dichte. Im Vergleich zu New Schiff Blutbildung, ist Innervation im Fettgewebe für eine lange Zeit unterschätzt worden. Vor kurzem, Zeng Et Al. 14 verwendet erweiterte intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie und gezeigt, dass Schichten von Nervenfasern14Adipozyten umgeben sind. Seither haben Forscher begonnen, die zentrale Rolle der sympathischen Innervation bei Regulierung der Fettgewebe Physiologie zu schätzen wissen. Daher ist es wichtig, einen einfachen und praktische Ansatz für Dokument adipösen Nerv Innervation zu entwickeln.
Hier berichten wir über eine optimierte Methode für die Co-Färbung von Blutgefäßen und Nervenfasern auf unsere früheren Protokollen basierende. Mit dieser Methode erreichen wir klare Bilder von Blutgefäßen und Nervenfasern ohne lauten Hintergrund. Darüber hinaus erhalten wir eine Resolution, die hoch genug ist für die Durchführung von quantitativen Messung der Dichte mit open-Source-Software. Mithilfe dieses neuen Ansatzes können wir erfolgreich die Strukturen und dichten der Blutgefäße und Nervenfasern in den verschiedenen adipose Depots vergleichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fettgewebe Umbau knüpft direkt an metabolischen Dysregulation bei Adipositas Entwicklung1,2. Angiogenese und sympathische Innervation sind unerlässlich für die dynamische umgestaltet Prozess2,12. Daher eines anwendbaren Ansatzes um die Bildung neuer Blutgefäße sowie Nervenfasern zu visualisieren sind von großer Bedeutung. Bisherige Methoden zur Dokumentation von Angiogenese im Fettgewebe berichtet. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch das National Institute of Health (NIH) Grant R01DK109001 (k.s.).
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
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