Co a coloração dos vasos sanguíneos e fibras nervosas no tecido adiposo
Summary
Formação da embarcação de sangue novo e inervação simpática desempenham um papel crucial na remodelação do tecido adiposo. No entanto, subsistem questões técnicas em Visualizar e medir quantitativamente o tecido adiposo. Aqui nós apresentamos um protocolo para rotular com êxito e comparar quantitativamente as densidades de vasos sanguíneos e fibras nervosas em diferentes tecidos adiposos.
Abstract
Estudos recentes têm destacado o papel crítico da angiogênese e inervação simpática no tecido adiposo remodelação durante o desenvolvimento da obesidade. Portanto, desenvolver um método fácil e eficiente para documentar as mudanças dinâmicas no tecido adiposo é necessário. Aqui, descrevemos uma abordagem de imunofluorescência modificada que eficientemente co manchas, vasos sanguíneos e fibras nervosas no tecido adiposo. Em comparação com métodos tradicionais e recentemente desenvolvidos, nossa abordagem é relativamente fácil de seguir e mais eficiente na rotulagem dos vasos sanguíneos e fibras nervosas com densidades maiores e menos fundo. Além disso, quanto maior a resolução das imagens ainda mais nos permite medir com precisão a área dos navios, quantidade de ramificação e comprimento das fibras por software de código aberto. Como uma demonstração usando o nosso método, mostramos que o tecido adiposo marrom (BAT) contém quantidades mais elevadas de vasos sanguíneos e fibras nervosas em relação ao tecido adiposo branco (WAT). Podemos ainda encontrar que entre os WATs, WAT subcutâneo (sWAT) tem mais vasos sanguíneos e fibras nervosas em relação ao epidídimo WAT (eWAT). Nosso método, portanto, fornece uma ferramenta útil para investigar a remodelação do tecido adiposo.
Introduction
Tecido adiposo tem chave metabólica e endócrina funções1. Isso dinamicamente aumenta ou diminui em resposta a diferentes nutrientes sublinha2. O tecido ativo processo de remodelação é composto por vários caminhos fisiológicas/etapas incluindo angiogênese, fibrose e formação de um microambiente inflamatório local2,3,4. Alguns estímulos físicos, tais como exposição fria e exercício, podem desencadear a ativação simpática, que em última análise, leva à formação de embarcação de sangue novo e inervação simpática em tecidos adiposos5,6. Estes processos de remodelação estão ligados firmemente a resultados metabólicos sistêmicos, incluindo a sensibilidade à insulina, a marca do tipo 2 diabetes2. Assim, a visualização dessas alterações patológicas é muito importante para compreender o estado saudável dos tecidos adiposos.
Angiogênese é o processo de formação da embarcação de sangue novo. Uma vez que os vasos sanguíneos fornecer oxigênio, nutrientes, hormônios e fatores de crescimento para o tecido, angiogênese foi considerado um passo fundamental no tecido adiposo remodelação, que tem sido documentado com diferentes técnicas6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. no entanto, subsistem dúvidas sobre a resolução das imagens, eficiência de imunocoloração e métodos para a quantificação da densidade do navio. Em relação à formação da embarcação de sangue novo, inervação no tecido adiposo foi subestimada por muito tempo. Recentemente, Zeng et al. 14 usado avançados de microscopia intravital dois fotões e demonstrou que os adipócitos estão cercados por camadas de fibras nervosas14. Desde então, os pesquisadores começaram a apreciar o papel fulcral da inervação simpática no Regulamento da fisiologia do tecido adiposo. Assim, desenvolver uma abordagem fácil e prática de inervação do nervo adiposa de documento é importante.
Aqui, nós relatamos um método otimizado para a coloração co de vasos sanguíneos e fibras nervosas, com base em nossos protocolos anteriores. Com este método, podemos conseguir imagens claras de vasos sanguíneos e fibras nervosas sem fundo ruidoso. Além disso, nós obtemos uma resolução que é alta o suficiente para executar a medição quantitativa de densidades com software de código aberto. Usando esta nova abordagem, podemos comparar com sucesso as estruturas e as densidades de vasos sanguíneos e fibras nervosas em diferentes depósitos adiposos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Remodela o tecido adiposo está diretamente ligada à desregulação metabólica durante o desenvolvimento de obesidade1,2. Angiogênese e inervação simpática são essenciais para a dinâmica remodela processo2,12. Portanto, desenvolver uma abordagem aplicável para visualizar os novos vasos sanguíneos, bem como as fibras nervosas são de grande importância. Métodos anteriores têm sido relatados pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado pelo Instituto Nacional de saúde (NIH) grant R01DK109001 (K.S.).
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
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