Co-macchiatura dei vasi sanguigni e fibre nervose nel tessuto adiposo
Summary
Formazione del vaso sanguigno di nuovo e lo stimolo simpatico svolgono un ruolo fondamentale nel rimodellamento del tessuto adiposo. Tuttavia, permangono problemi tecnici nella visualizzazione e quantitativamente misurando il tessuto adiposo. Qui presentiamo un protocollo per etichettare correttamente e confrontare quantitativamente le densità dei vasi sanguigni e fibre nervose in diversi tessuti adiposi.
Abstract
Recenti studi hanno evidenziato il ruolo critico dell’angiogenesi e stimolo simpatico nel rimodellamento del tessuto adiposo durante lo sviluppo dell’obesità. Pertanto, lo sviluppo di un metodo semplice ed efficace per documentare i cambiamenti dinamici nel tessuto adiposo è necessario. Qui, descriviamo un metodo immunofluorescente modificato che efficacemente co-macchie vasi sanguigni e fibre nervose in tessuti adiposi. Rispetto ai metodi tradizionali e sviluppati di recente, il nostro approccio è relativamente facile da seguire e più efficiente in etichettatura i vasi sanguigni e fibre nervose con densità più elevate e meno lo sfondo. Inoltre, la maggiore risoluzione delle immagini ulteriormente permette di misurare con precisione la zona dei vasi, la quantità di ramificazione e dalla lunghezza delle fibre di software open source. Come una dimostrazione con il nostro metodo, vi indichiamo che il tessuto adiposo marrone (pipistrello) contiene una maggiore quantità di vasi sanguigni e fibre nervose rispetto al tessuto adiposo bianco (WAT). Inoltre trovare che tra i Wat, WAT sottocutaneo (sWAT) ha più vasi sanguigni e fibre nervose rispetto al WAT epididimaria (eWAT). Il nostro metodo fornisce pertanto uno strumento utile per indagare il rimodellamento del tessuto adiposo.
Introduction
Tessuto adiposo ha chiave metabolica ed endocrina funzioni1. Si espande o si contrae in risposta a differenti dinamicamente nutriente sottolinea2. Il tessuto attivo processo di rimodellamento è costituito da più percorsi/passaggi fisiologici tra cui l’angiogenesi, la fibrosi e la modellatura di microambienti infiammatoria locale2,3,4. Alcuni stimoli fisici, quali esposizione al freddo e l’esercizio, possono innescare l’attivazione simpatica, che infine conduce alla formazione del vaso sanguigno di nuovo e lo stimolo simpatico in tessuti adiposi5,6. Questi processi di rimodellamento sono collegati strettamente ai risultati metabolici sistemici compreso la sensibilità dell’insulina, il segno distintivo di tipo 2 il diabete2. Così, la visualizzazione di queste mutazioni patologiche è molto importante per comprendere lo stato integro di interi tessuti adiposi.
L’angiogenesi è il processo di formazione del vaso sanguigno di nuovo. Poiché i vasi sanguigni fornire ossigeno, nutrienti, ormoni e fattori di crescita del tessuto, l’angiogenesi è stata considerata un passo fondamentale nel rimodellamento del tessuto adiposo, che è stato documentato con tecniche differenti6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Tuttavia, persistono dubbi la risoluzione delle immagini, efficienza di immunostaining e metodi per la quantificazione della densità della nave. Rispetto alla formazione del vaso sanguigno di nuovo, lo stimolo nel tessuto adiposo è stato sottovalutato per lungo tempo. Recentemente, Zeng et al.. 14 usato avanzata videomicroscopia microscopia del due-fotone e dimostrato che adipocytes sono circondati da strati di fibre nervose14. Da allora, i ricercatori hanno iniziato ad apprezzare il ruolo fondamentale di stimolo simpatico nel regolamento della fisiologia del tessuto adiposo. È quindi importante sviluppare un approccio facile e pratico per lo stimolo del nervo adiposa documento.
Qui, segnaliamo un metodo ottimizzato per la co-colorazione dei vasi sanguigni e fibre nervose basate sui nostri protocolli precedenti. Con questo metodo, possiamo ottenere immagini chiare dei vasi sanguigni e fibre nervose senza sfondo rumoroso. Inoltre, otteniamo una risoluzione che è sufficientemente elevata per eseguire la misurazione quantitativa della densità con software open source. Utilizzando questo nuovo approccio, possiamo confrontare correttamente le strutture e la densità dei vasi sanguigni e fibre nervose in diversi depositi adiposi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rimodellamento del tessuto adiposo è direttamente collegato al dysregulation metabolico durante lo sviluppo dell’obesità1,2. Angiogenesi e stimolo simpatico sono entrambi essenziali per il rimodellamento dinamico processo2,12. Di conseguenza, lo sviluppo di un approccio applicabile per visualizzare i nuovi vasi sanguigni così come le fibre nervose sono di grande importanza. Metodi precedenti sono stati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dall’Istituto nazionale di sovvenzione di salute (NIH) R01DK109001 (a K.S.).
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
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| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
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