सह दाग रक्त वाहिकाओं और वसा ऊतक में तंत्रिका तंतुओं
Summary
नई रक्त वाहिका गठन और सहानुभूति इन्नेर्वतिओन वसा ऊतक remodeling में निर्णायक भूमिका निभाते हैं । हालांकि, वहां तकनीकी मुद्दों visualizing और मात्रात्मक वसा ऊतक मापने में रहते हैं । यहाँ हम सफलतापूर्वक लेबल और मात्रात्मक विभिन्न वसा ऊतकों में रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं के घनत्व तुलना करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।
Abstract
हाल के अध्ययनों में मोटापे के विकास के दौरान वसा ऊतक remodeling में angiogenesis और सहानुभूति इन्नेर्वतिओन की महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला है । इसलिए, वसा ऊतक में गतिशील परिवर्तन दस्तावेज़ के लिए एक आसान और कुशल विधि विकसित करना आवश्यक है । यहां, हम एक संशोधित immunofluorescent दृष्टिकोण का वर्णन है कि कुशलता से सह दाग रक्त वाहिकाओं और वसा ऊतकों में तंत्रिका तंतुओं । पारंपरिक और हाल ही में विकसित तरीकों की तुलना में, हमारे दृष्टिकोण का पालन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है और उच्च घनत्व और कम पृष्ठभूमि के साथ रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं लेबलिंग में अधिक कुशल. इसके अलावा, छवियों के उच्च संकल्प आगे हमें सही जहाजों के क्षेत्र को मापने के लिए अनुमति देता है, शाखाओं में बंटी की राशि है, और खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के द्वारा फाइबर की लंबाई । एक प्रदर्शन के रूप में हमारे विधि का उपयोग कर, हम बताते है कि ब्राउन वसा ऊतक (चमगादड़) रक्त वाहिकाओं और सफेद वसा ऊतक (वाट) की तुलना में तंत्रिका तंतुओं की उच्च मात्रा में शामिल हैं । हम आगे पाते है कि वाटों के बीच, चमड़े के नीचे वाट (स्वात) और अधिक रक्त वाहिकाओं और epididymal वाट (eWAT) की तुलना में तंत्रिका तंतुओं है । हमारे विधि इस प्रकार वसा ऊतक remodeling की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है ।
Introduction
वसा ऊतक कुंजी चयापचय और अंत में स्रावी कार्यों1. यह गतिशील रूप से फैलता है या अलग पोषक तत्वों के जवाब में सिकुड़ती2तनाव । angiogenesis, फाइब्रोसिस, और स्थानीय भड़काऊ microenvironments2,3,4का आकार देने सहित सक्रिय ऊतक remodeling प्रक्रिया के कई शारीरिक रास्तों/ कुछ शारीरिक उत्तेजनाओं, जैसे कि शीत जोखिम और व्यायाम, सहानुभूति सक्रियण ट्रिगर हो सकता है, जो अंततः नए रक्त वाहिका गठन और वसा ऊतकों में सहानुभूति इन्नेर्वतिओन की ओर जाता है5,6. इन remodeling प्रक्रियाओं को कसकर इंसुलिन संवेदनशीलता सहित प्रणालीगत चयापचय परिणामों के लिए लिंक कर रहे हैं, प्रकार की पहचान 2 मधुमेह2. इस प्रकार, इन रोग परिवर्तन के दृश्य पूरे वसा ऊतकों की स्वस्थ स्थिति को समझने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है ।
Angiogenesis नए रक्त वाहिनियों के गठन की प्रक्रिया है. के बाद से रक्त वाहिकाओं ऑक्सीजन प्रदान करते हैं, पोषक तत्वों, हार्मोन, और ऊतकों को विकास कारकों, angiogenesis वसा ऊतक remodeling है, जो विभिंन तकनीकों6,7 के साथ प्रलेखित किया गया है में एक महत्वपूर्ण कदम माना गया है, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. हालांकि, वहां छवियों, immunostaining की दक्षता, और पोत घनत्व के ठहराव के लिए तरीकों के संकल्प के बारे में सवाल रहते हैं । नए रक्त वाहिका गठन की तुलना में, वसा ऊतक में इन्नेर्वतिओन एक लंबे समय के लिए आंका गया है । हाल ही में, Zeng एट अल। 14 उन्नत intravital दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया और दिखाया कि adipocytes तंत्रिका तंतुओं की परतों से घिरे हुए हैं14. तब से, शोधकर्ताओं ने वसा ऊतक फिजियोलॉजी के विनियमन में सहानुभूति इन्नेर्वतिओन की निर्णायक भूमिका की सराहना करने के लिए शुरू कर दिया है । इस प्रकार, वसा तंत्रिका इन्नेर्वतिओन दस्तावेज़ के लिए एक आसान और व्यावहारिक दृष्टिकोण विकसित करना महत्वपूर्ण है ।
यहां, हम सह के लिए एक अनुकूलित विधि रिपोर्ट रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं के दाग हमारे पिछले प्रोटोकॉल के आधार पर । इस विधि के साथ, हम शोर पृष्ठभूमि के बिना रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं की स्पष्ट छवियों को प्राप्त कर सकते हैं । इसके अलावा, हम एक संकल्प है कि खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के साथ घनत्व की मात्रात्मक माप प्रदर्शन के लिए पर्याप्त उच्च है प्राप्त करते हैं । इस नए दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम सफलतापूर्वक संरचनाओं और विभिन्न वसा डिपो में रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं के घनत्व की तुलना कर सकते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वसा ऊतक पुनर्मॉडलिंग सीधे मोटापा विकास के दौरान चयापचय dysregulation से जुड़ा हुआ है1,2. Angiogenesis और सहानुभूति इन्नेर्वतिओन दोनों गतिशील remodeling प्रक्रिया2,12के लिए आवश्यक ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ (NIH) ग्रांट R01DK109001 (टू कृष्णसिंह) ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
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