Co flekker blod fartøy og Nerve fiber i fettvev
Summary
Nytt blod fartøy dannelse og sympatisk gir spille viktige roller i fettvev remodeling. Det gjenstår imidlertid tekniske problemer i visualisere og kvantitativt måle fettvev. Her presenterer vi en protokoll for å kunne merke og kvantitativt sammenligne tettheter av blod fartøy og nerve fiber i forskjellige liggende under adipose vev.
Abstract
Nyere studier har fremhevet kritisk rolle angiogenese og sympatisk gir i fettvev remodeling under utviklingen av fedme. Det er derfor nødvendig å utvikle en enkel og effektiv metode for å dokumentere de dynamiske endringene i fettvev. Her beskriver vi en modifisert immunofluorescent tilnærming som effektivt co flekker blod fartøy og nerve fiber i liggende under adipose vev. Sammenlignet med tradisjonelle og nylig utviklet metoder, er vår tilnærming relativt enkle å følge og mer effektive i merking blodkar og nervefibrene med høyere tetthet og mindre bakgrunn. Videre tillater høyere oppløsning av bildene ytterligere oss å måle nøyaktig området av fartøy, mengde forgrening, og lengden på fiber av open source programvare. Som en demonstrasjon ved hjelp av vår metode, viser vi den brune fettvev (BAT) inneholder større mengder blod fartøy og nerve fibre sammenlignet med hvit fettvev (WAT). Vi videre finner at blant WATs, subkutan WAT (sWAT) har mer blod fartøy og nerve fiber i forhold til epididymal WAT (eWAT). Vår metode gir dermed et nyttig verktøy for å undersøke fettvev remodeling.
Introduction
Fettvev har metabolske og endokrine fungerer1. Det dynamisk utvides eller forminskes svar på ulike næringsstoffer understreker2. Aktive vev remodeling prosessen består av flere fysiologiske baner/trinn inkludert angiogenese fibrose og utformingen av lokale inflammatorisk microenvironments2,3,4. Noen fysiske stimuli, som kaldt eksponering og mosjon, kan utløse sympatisk aktivisering, som til slutt fører til dannelse av nytt blod fartøy og sympatisk gir i liggende under adipose vev5,6. Prosessene remodeling er knyttet tett til systemisk metabolsk resultater inkludert insulinfølsomhet, kjennetegnet av type 2 diabetes2. Dermed er visualisering av disse patologiske forandringer svært viktig å forstå sunne status for hele liggende under adipose vev.
Angiogenese er prosessen av nytt blod fartøy formasjon. Siden blodkar skaffe oksygen, næringsstoffer, hormoner og vekstfaktorer til vev, angiogenese har vært ansett som et viktig skritt i fettvev remodeling, som har blitt dokumentert med ulike teknikker6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. det beholdes imidlertid spørsmål om oppløsningen på bildene, effektiviteten av immunostai- og metoder for kvantifisering av fartøyet. Sammenlignet med nytt blod fartøy formasjon, har gir i fettvev vært undervurdert i lang tid. Nylig Zeng et al. 14 brukes Avansert intravital to-fotonet mikroskopi og vist at adipocytter er omgitt av lag av nerve fibre14. Siden da begynte forskere å verdsette den avgjørende rollen sympatisk gir i regulering av fettvev fysiologi. Derfor er det viktig å utvikle en enkel og praktisk tilnærming til dokumentet adipose nerve gir.
Her rapporterer vi en optimalisert metode for den co flekker av blod fartøy og nerve fiber basert på våre tidligere protokoller. Med denne metoden kan vi oppnå klare bilder av blod fartøy og nerve fiber uten støyende bakgrunn. Dessuten får vi en oppløsning som er høy nok til å utføre kvantitativ måling av tettheter med åpen kildekode. Ved hjelp av denne nye tilnærmingen, kan vi kunne sammenligne strukturer og tettheter av blod fartøy og nerve fiber i forskjellige adipose depoter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fettvev remodeling er direkte knyttet til metabolske feilregulering under fedme utvikling1,2. Angiogenese og sympatisk gir er både viktig for dynamisk remodeling prosessen2,12. Derfor utvikler en gjeldende tilnærming for å se den nye blodkar, samt nerve fiber er av stor betydning. Metodene er rapportert for å dokumentere angiogenese i fettvev. Imidlertid fortsatt noen problemer med disse tilnærminger…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av National Institute of Health (NIH) grant R01DK109001 (til K.S.).
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
