زخرفه ثلاثية الابعاد من الاغشيه البيولوجية المهندسة مع بيوركانتر تفعل ذلك بنفسك
Summary
توضح هذه المقالة طريقه تحويل طابعه ثلاثية الابعاد تجاريه منخفضه التكلفة إلى طابعه ثلاثية الابعاد بكتيرية يمكنها تسهيل طباعه الاغشيه البيولوجية المنقوشة. وتوصف جميع الجوانب الضرورية لاعداد البيولوجية والحبر الحيوي ، فضلا عن أساليب التحقق لتقييم تكوين الاغشيه البيولوجية.
Abstract
الاغشيه البيولوجية هي مجاميع من البكتيريا المضمنة في مصفوفة ذاتية الإنتاج ذات نقوش مكانيه. البكتيريا داخل بيوفيلم تطوير مقاومه المضادات الحيوية المعززة ، والتي تشكل المخاطر الصحية المحتملة ، ولكن يمكن أيضا ان تكون مفيده للتطبيقات البيئية مثل تنقيه مياه الشرب. سيتطلب تطوير المزيد من العلاجات المضادة للبكتيريا والتطبيقات المستوحية من بيوفيلم تطوير طرق قابله للنسخ والهندسة لإنشاء بيوفيلم. في الاونه الاخيره ، تم تطوير طريقه جديده لاعداد بيوفيلم باستخدام طابعه ثلاثية الابعاد (3D) معدله مع حبر بكتيري. توضح هذه المقالة الخطوات اللازمة لبناء هذا فعاله ، منخفضه التكلفة 3D بيوركانتر التي توفر تطبيقات متعددة في معالجه المواد المستحثة بالجراثيم. يبدا البروتوكول بطابعه تجاريه ثلاثية الابعاد تمت الاستعاضة فيها عن الطارد بموزع الحبر الحيوي المتصل بنظام ضخ المحاقن مما يتيح تدفقا مستمرا وقابلا للتحكم من الحبر الحيوي. لتطوير الحبر الحيوي مناسبه للطباعة بيوفيلم ، تم تعليق البكتيريا القولونية التي تمت هندستها في محلول من الجينات ، بحيث يصلب في اتصال مع سطح يحتوي علي الكالسيوم. ان ادراج ماده كيميائية محفز داخل الركيزة الطباعة يدفع التعبير عن البروتينات بيوفيلم داخل الحبر الحيوي المطبوعة. تمكن هذه الطريقة من الطباعة ثلاثية الابعاد للأنماط المكانية المختلفة المكونة من طبقات منفصلة من الاغشيه البيولوجية المطبوعة. ويمكن لهذه الاغشيه الحيوية المتحكم فيها مكانيا ان تكون بمثابه نظم نموذجيه ويمكن ان تجد تطبيقات في مجالات متعددة لها تاثير واسع النطاق علي المجتمع ، بما في ذلك منع مقاومه المضادات الحيوية أو تنقيه مياه الشرب ، من بين أمور أخرى.
Introduction
وهناك حاليا حاجه متزايدة إلى وضع حلول مستدامه وصديقه للبيئة لإنتاج المواد المنقوشة مكانيا ، بسبب العدد المتزايد من الأسواق لهذه المواد1. يقدم هذا المقال طريقه بسيطه واقتصاديه لإنتاج هذه المواد ، التالي يقدم طيفا واسعا من التطبيقات في المستقبل. تسمح الطريقة المعروضة هنا بالطباعة ثلاثية الابعاد (3D) للهياكل المنقوشة مكانيا باستخدام الحبر الحيوي الذي يحتوي علي البكتيريا الحية. تبقي البكتيريا قابله للحياة داخل الهياكل المطبوعة لأكثر من أسبوع واحد ، مما يمكن البكتيريا من أداء الانشطه الايضيه الطبيعية أو المهندسة. البكتيريا المطبوعة التالي يمكن ان تنتج وتودع المكونات المطلوبة داخل الهيكل المطبوع ، علي سبيل المثال خلق بيوفيلم الوظيفية عبر المرتبطة2.
وتنطوي الأساليب التقليدية لإنتاج المواد المتقدمة علي نفقات عاليه للطاقة (مثل ارتفاع درجات الحرارة و/أو الضغوط) ويمكن ان تنتج كميات كبيره من النفايات الكيميائية ، وكثيرا ما تكون مواد سامه تتطلب استخداما واسع النطاق للتكاليف3 ،4. وعلي النقيض من ذلك ، فان الأنواع البكتيرية المتعددة قادره علي إنتاج مواد يمكن تطبيقها بسهوله في مختلف الصناعات. وتشمل هذه المواد البوليمرات مثل polyhydroxyalkanoates (فا)5 أو بولي (غليكوليد-lactide) (pgla)6، السليلوز البكتيرية7، مواد الخرسانة البكتيرية8، المركبات الحيوية9، المواد اللاصقة اميلويد المستندة إلى10، أو الحيوي القائم علي مفاتيح الكهربائية11، من بين أمور أخرى. وعلاوة علي ذلك ، فان إنتاج البكتيريا من المواد الثمينة يحدث عاده عند درجات حرارة وضغوط شبه محيطه وفي بيئات مائية ، دون الحاجة إلى مركبات سامه أو إنتاجها. في حين ان إنتاج المواد مع البكتيريا قد ثبت في الأدبيات وبعض التطبيقات الصناعية قد ظهرت بالفعل12,13, ولا تزال طريقه موثوقه لزخرفه المكانية من هذه المواد تحديا.
توضح هذه المقالة طريقه مباشره لتحويل طابعه ثلاثية الابعاد تجاريه منخفضه التكلفة إلى طابعه بكتيرية ثلاثية الابعاد. ويوضح البروتوكول كيفيه اعداد الحبر الحيوي الذي يحتوي علي البكتيريا الحية والمحافظة عليها ، فضلا عن كيفيه اعداد الركائز التي يمكن ان تؤدي اليها الطباعة ثلاثية الابعاد. هذه الطريقة مناسبه للاستخدام مع مجموعه متنوعة من السلالات البكتيرية الطبيعية والمهندسة قادره علي إنتاج المواد. هذه البكتيريا يمكن توزيعها مكانيا ضمن بنيه مطبوعه ثلاثية الابعاد ولا تزال تواصل نشاطها الأيضي ، والذي سيؤدي إلى توزيع مكاني للمواد المطلوبة التي تنتجها البكتيريا.
هذه الطريقة الطباعة تمكن من تصنيع المضافة من الاغشيه البيولوجية ، والمجاميع من البكتيريا محاطه مصفوفة خارج الخلية المنتجة ذاتيا. الاغشيه البيولوجية هي شبكات ثلاثية الابعاد غير متجانسة حيث البروتينات والبوليمرات والخلايا البكتيرية والأكسجين والمواد المغذية كلها مهيكله مكانيا14. بينما في شكل بيوفيلم ، تظهر البكتيريا زيادة مقاومه المضادات الحيوية والمتانة الهيكلية ، مما يجعل من الصعب القضاء عليها من الأسطح بما في ذلك القسطرة الطبية ويزرع. المفتاح إلى [بيوفيلم] خاصيه, وأيضا التحدي كبيره إلى [بيوفيلم] بحث, يبدو ان التغاير من [بيوفيلومس]15,16,17. ويعد إنتاج الاغشيه البيولوجية النموذجية الخاضعة للمراقبة المكانية اهتماما خاصا لأنه سيسمح اما باستنساخ أو توليف الأنماط المكانية لمكونات بيوفيلم ، مما يساعد علي فهم ترسبات الاغشيه البيولوجية المستقرة علي اي سطح تقريبا في الطبيعه.
تقدم هذه المقالة طريقه لإنتاج الاغشيه البيولوجية باستخدام المواد الهلامية المائية المطبوعة ثلاثية الابعاد التي تحتوي علي بكتيريا القولونية المهندسة التي تنتج بروتينات بيوفيلم في وجود محفز ، فضلا عن أساليب التحقق من تشكيل بيوفيلم 2 . المكونات الرئيسية المصفوفة خارج الخلية من هذه الاغشيه البيولوجية هي curli اميلويد ألياف18 التي تحتوي علي البروتينات csga تجميعها ذاتيا. عند هندستها e. البكتيريا القولونية هي المستحثة للتعبير عن البروتينات csga ، فانها تشكل نموذج بيوفيلم مستقره التي تحمي الخلايا ضد يجري غسلها من سطح الطباعة. مثل هذا 3d المطبوعة بيوفيلم يمكن التحكم فيها مكانيا ، ويمكن ان تكون بمثابه أداه بحثيه مفيده للتحقيق في متعددة المقاييس بيوفيلم هيكل-وظيفة الميكانيكا أو المادية19. وسوف تساعد هذه الاغشيه الحيوية مفصل فهم مبادئ تشكيل بيوفيلم وخصائصها الميكانيكية ، مما يتيح المزيد من البحث في أليات مقاومه المضادات البيولوجية بين التطبيقات الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول المعروض هنا للطباعة ثلاثية الابعاد من الاغشيه الحيوية المهندسة له خطوتين حاسمتين. الأول هو اعداد سطح الطباعة أجار ، وهو العامل الأكثر اهميه لإنتاج دقه الطباعة محدده. من المهم التاكد من ان سطح الطباعة مسطح وانه يتم وضع طرف الماصة علي الراس في الارتفاع الصحيح من السطح. إذا لم يكن …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من الأرض (رقم FA2386-4059) ، المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO/أؤبن كورس واير) كجزء من برنامج افاق العلوم النانويه ، وبرنامج المواد المتقدمة NWO-NSFC (رقم 729.001.016). ويعترف المؤلفون بالمساعدة المختبرية لرامون فان دير فألك ورولان Kieffer.
Materials
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
