Bioprinter で設計されたバイオフィルムの三次元パターン化
Summary
この記事では、低コストの商用3D プリンタを、パターン化したバイオフィルムの印刷を容易にすることができる細菌3D プリンタに変換する方法について説明します。Bioprinter およびバイオインクの調製に必要なすべての側面、ならびにバイオフィルムの形成を評価するための検証方法について説明する。
Abstract
バイオフィルムは、自己産生空間的パターン化された細胞外マトリックスに埋め込まれる細菌の凝集体である。バイオフィルム内の細菌は、潜在的な健康上の危険をもたらす強化された抗生物質耐性を開発しますが、飲料水の浄化などの環境アプリケーションにも有益です。抗菌薬とバイオフィルムに触発されたアプリケーションのさらなる発展には、バイオフィルム作成のための再現性のある、engineerable 方法の開発が必要になります。近年、細菌インクを用いて改質された三次元 (3D) プリンタを用いたバイオフィルム調製の新規な方法が開発されるようになった。この記事では、bacterially によって誘導される材料処理に複数のアプリケーションを提供する、この効率的で低コストの 3D bioprinter を構築するために必要な手順について説明します。このプロトコルは適合した市販の3D プリンタで始まり、押出機がシリンジ・ポンプ・システムに接続されたバイオインクディスペンサーに交換されることにより、バイオインクの制御可能で連続的な流れができる。バイオフィルムの印刷に適した生体インクを開発するために、設計された大腸菌細菌はアルギン酸塩の溶液中に懸濁し、カルシウムを含有する表面と接触して固化する。印刷基板内のインデューサー化学物質の含有は、印刷されたバイオインク内のバイオフィルムタンパク質の発現を駆動する。この方法は、印刷されたバイオフィルムの離散層からなる様々な空間パターンの3D プリンティングを可能にします。このような空間的に制御されたバイオフィルムは、モデルシステムとして機能し、抗生物質耐性予防や飲料水の浄化など、社会に幅広い影響を与える複数の分野のアプリケーションを見つけることができます。
Introduction
現在、このような材料の市場の数が拡大しているため、空間的にパターン化された材料の生産のための環境に優しい、持続可能なソリューションを開発する必要性が高まっています1.この記事は、このような材料の生産のためのシンプルで経済的な方法を提示し、したがって、将来のアプリケーションの大規模なスペクトルを提供しています。ここで紹介する方法は、生きた細菌を含む生体インクを用いて、空間的にパターン化された構造物の三次元 (3D) 印刷を可能にする。細菌は、1週間以上にわたってプリントされた構造内で生存可能なままであり、細菌は自然または操作された代謝活動を行うことができる。印刷された細菌は、それにより、印刷構造内で所望の成分を生成及び堆積することができ、例えば機能的架橋型バイオフィルム2を作成する。
高度な材料を製造するための従来の方法は、高いエネルギー支出 (例えば、高温および/または圧力) を伴い、大量の化学廃棄物を生成することができ、多くの場合、コストを必要とする有毒物質3 、4.対照的に、複数の細菌種は、様々な産業で容易に適用できる材料を製造することができる。これらの材料は、polyhydroxyalkanoates (PHA)5またはポリ (グリコリドコポリマー) (PGLA)6、細菌セルロース7、細菌性コンクリート材料8、バイオミメティック複合材9などのポリマーを含む、アミロイド系接着剤10、またはバイオベースの電気スイッチ11、とりわけ。さらに、貴重な材料の細菌生産は、典型的には、有毒な化合物を必要または生成することなく、周囲の温度および圧力および水性環境で行われる。細菌を用いて材料を製造することは文献において実証されているが、いくつかの産業用途はすでに12,13に浮上しており、そのような材料の空間的パターニングのための信頼できる方法は課題のままである。
この記事では、低コストの商用3D プリンタを3D の細菌プリンタに変換するための簡単な方法を紹介します。このプロトコルは、生きている細菌を含むバイオインクを調製する方法、ならびに3D プリンティングを行うことができる基質を調製する方法を示しています。この方法は、材料を生産することができる天然および設計された細菌株の様々な使用に適しています。これらの細菌は、3D プリントされた構造内に空間的に分散することができ、依然としてその代謝活性を継続し、これは、細菌によって生成された所望の材料の空間的分布をもたらすであろう。
この印刷方法により、バイオフィルム、自己産生細胞外マトリックスに囲まれた細菌の凝集体の添加物製造が可能になる。バイオフィルムは、タンパク質、ポリマー、細菌細胞、酸素、および栄養素がすべて空間的に構造化された14の異種3d ネットワークです。バイオフィルムの形態では、バクテリアは抗生物質の耐性と構造的な頑健性を高め、医療用カテーテルやインプラントを含む表面からの根絶を困難にしています。バイオフィルムの特性にとって重要なことは、またバイオフィルム研究への最大の課題であり、バイオフィルム15、16、17の不均一性であると思われる。空間的に制御されたモデルバイオフィルムの生産は、バイオフィルム成分の空間パターンを再生または調整することを可能にし、事実上あらゆる表面のバイオフィルムの安定した沈着の理解を助けるため、特別な関心を持っています自然。
本稿では、インデューサーの存在下でバイオフィルムタンパク質を生成する工学的大腸菌細菌を含む3D プリントされたヒドロゲルを用いたバイオフィルムの製造方法、ならびにバイオフィルム形成の検証方法を紹介する。 .これらのバイオフィルムの主要な細胞外マトリックス成分は、自己組織化された CsgA タンパク質を含む curli アミロイド繊維18である。CsgA のタンパク質を発現させるために大腸菌の細菌が誘導されると、それらは、印刷面から洗い流されて細胞を保護する安定したモデルバイオフィルムを形成する。このような3D プリントバイオフィルムは、空間的に制御することができ、マルチスケールのバイオフィルム構造機能力学または materiomics19の調査のための有用な研究ツールとして機能することができます。これらのオーダーメイドのバイオフィルムは、バイオフィルム形成の原理とその機械的特性の理解を助け、他のアプリケーションの間で抗生物質耐性のメカニズムのさらなる研究を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
エンジニアリングバイオフィルムの3D プリンティングのためにここに提示されたプロトコルは、2つの重要なステップを持っています。まず、特定の印刷解像度を生成するための最も重要な要因である寒天印刷面の調製です。印刷表面が平らであり、プリントヘッド上のピペットチップが表面から正しい高さに位置していることを確認することが重要です。サーフェスが平坦でない場合、印刷…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は AOARD の助成金によって支えられました (No.FA2386-1-4059)、オランダ科学研究機構 (NWO/OCW) は、ナノサイエンスプログラムのフロンティアの一部として、先端材料 NWO ・ NSFC プログラム (729.001.016)。著者たちは、ラモン・ヴァン・デル・ヴァルクとローランド・ Kieffer の実験支援を承認した。
Materials
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
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