Driedimensionale patroon van gemanipuleerde biofilmen met een doe-het-zelf bioprinter
Summary
Dit artikel beschrijft een methode voor het transformeren van een goedkope commerciële 3D-printer in een bacteriële 3D-printer die het afdrukken van gedessineerde biofilmen kan vergemakkelijken. Alle noodzakelijke aspecten van de voorbereiding van de bioprinter en bio-Ink worden beschreven, evenals verificatiemethoden om de vorming van biofilmen te beoordelen.
Abstract
Biofilms zijn aggregaten van bacteriën ingebed in een zelf geproduceerde ruimtelijk-patroon extracellulaire matrix. Bacteriën in een biofilm te ontwikkelen verbeterde antibioticaresistentie, die potentiële gevaren voor de gezondheid vormt, maar kan ook gunstig zijn voor milieu-toepassingen, zoals zuivering van drinkwater. De verdere ontwikkeling van anti-bacteriële therapeutische en biofilm-geïnspireerde toepassingen zal de ontwikkeling van reproduceerbare, ingenieurable methodes voor biofilm verwezenlijking vereisen. Onlangs is een nieuwe methode van biofilm voorbereiding met behulp van een aangepaste driedimensionale (3D) printer met een bacteriële inkt is ontwikkeld. Dit artikel beschrijft de stappen die nodig zijn om deze efficiënte, goedkope 3D bioprinter die meerdere toepassingen in bacteriële-geïnduceerde materiaal verwerking biedt te bouwen. Het protocol begint met een aangepaste commerciële 3D-printer waarin de extruder is vervangen door een bio-inkt dispenser aangesloten op een spuitpomp systeem waardoor een controleerbare, continue stroom van bio-inkt. Om een bio-inkt te ontwikkelen die geschikt is voor het drukken van biofilm, werden de gemanipuleerde bacteriën van Escherichia coli opgeschort in een oplossing van alginaat, zodat zij in contact met een oppervlakte stollen die calcium bevat. De opneming van een inductor chemisch product binnen het druk substraat drijft uitdrukking van biofilm proteïnen binnen de gedrukte bio-inkt. Deze methode maakt het mogelijk 3D-afdrukken van verschillende ruimtelijke patronen, bestaande uit discrete lagen van gedrukte biofilmen. Dergelijke ruimtelijk gecontroleerde biofilmen kunnen als modelsystemen dienen en kunnen toepassingen in veelvoudige gebieden vinden die een brede invloed op de maatschappij, met inbegrip van antibiotische weerstands preventie of drinkwaterreiniging, onder anderen hebben.
Introduction
Er is momenteel een toenemende behoefte aan milieuvriendelijke, duurzame oplossingen te ontwikkelen voor de productie van ruimtelijk gedessineerde materialen, als gevolg van het groeiende aantal markten voor dergelijke materialen1. Dit artikel stelt een eenvoudige, economische methode voor de productie van dergelijke materialen voor en biedt daarom een groot spectrum van toekomstige toepassingen aan. De hier gepresenteerde methode maakt het mogelijk driedimensionale (3D) afdrukken van ruimtelijke structuren met behulp van een bio-inkt met levende bacteriën. Bacteriën blijven levensvatbaar binnen de gedrukte structuren voor meer dan een week, waardoor de bacteriën om natuurlijke of engineered metabole activiteiten uit te voeren. Gedrukte bacteriën kunnen daardoor de gewenste componenten binnen de gedrukte structuur produceren en deponeren, bijvoorbeeld het creëren van een functionele cross-linked biofilm2.
Traditionele methoden voor de productie van geavanceerde materialen te betrekken hoge energie-uitgaven (bijv. hoge temperaturen en/of druk) en kan produceren grote hoeveelheden chemisch afval, vaak toxische stoffen die kosten-uitgebreid gebruik vereisen3 ,4. In tegenstelling, meerdere bacteriële soorten zijn in staat om materialen die gemakkelijk toepasbaar kunnen zijn in verschillende industrieën te produceren. Deze materialen omvatten polymeren zoals polyhydroxyalkanoaten (PHA)5 of poly (glycolide-co-lactide) (PGLA)6, bacteriële cellulose7, bacteriële concrete materialen8, Biomimetic composieten9, amyloid lijmen10, of Bio-based elektrische schakelingen11, onder anderen. Bovendien, bacteriële productie van waardevolle materialen meestal plaatsvindt op bijna-omgeving temperaturen en druk en in waterige omgevingen, zonder dat of het produceren van toxische verbindingen. Terwijl de productie van materialen met bacteriën is aangetoond in de literatuur en sommige industriële toepassingen zijn al naar voren gekomen12,13, een betrouwbare methode voor ruimtelijke patroon van dergelijke materialen blijft een uitdaging.
Dit artikel toont een rechttoe rechtaan methode van het omzetten van een goedkope commerciële 3D-printer in een 3D-bacteriële printer. Het protocol laat zien hoe u een bio-inkt voor te bereiden met en het behoud van de levende bacteriën, alsmede hoe substraten op waarop de 3D-druk kan worden uitgevoerd voor te bereiden. Deze methode is geschikt om te gebruiken met een verscheidenheid van natuurlijke en gemanipuleerde bacteriestammen in staat om materialen te produceren. Deze bacteriën kunnen ruimtelijk worden verdeeld binnen een 3D-gedrukte structuur en nog steeds hun metabole activiteit, die zal resulteren in een ruimtelijke verdeling van de gewenste materialen geproduceerd door de bacterie.
Deze drukmethode maakt additieve productie van biofilmen, aggregaten van bacteriën omgeven door een zelf geproduceerde extracellulaire matrix. Biofilms zijn heterogene 3D-netwerken waarin eiwitten, polymeren, bacteriële cellen, zuurstof en voedingsstoffen zijn allemaal ruimtelijk gestructureerd14. Terwijl in de vorm van een biofilm, bacteriën vertonen een verhoogde antibioticaresistentie en structurele robuustheid, waardoor ze moeilijk uit te roeien van oppervlakken, waaronder medische katheters en implantaten. De sleutel tot biofilm eigenschappen, en ook de grootste uitdaging voor biofilm onderzoek, lijkt de heterogeniteit van de biofilmen15,16,17. De productie van ruimtelijk gecontroleerde model biofilmen is van bijzonder belang omdat het de ruimtelijke patronen van biofilm componenten zou kunnen reproduceren of afstemmen, waardoor het begrip van de stabiele afzetting van biofilmen op vrijwel elk oppervlak in Aard.
Dit artikel presenteert een methode voor de productie van biofilmen met behulp van 3D-gedrukte hydrogels met gemanipuleerde E. coli bacteriën die biofilm eiwitten te produceren in de aanwezigheid van een inductor, alsmede de methoden van verificatie van de biofilm formatie2 . De belangrijkste extracellulaire matrix componenten van deze biofilmen zijn curli kuller amyloid vezels18 die zelf-geassembleerd CsgA eiwitten bevatten. Wanneer de ontworpen E. coli bacteriën worden bewogen om CsgA proteïnen uit te drukken, vormen zij een stabiel model biofilm dat de cellen tegen wordt weggespoeld van de drukoppervlakte beschermt. Een dergelijke 3D gedrukte biofilm kan ruimtelijk worden gecontroleerd en kan dienen als een nuttig onderzoek instrument voor het onderzoek van multischaalde biofilm structuur-functie mechanica of materiomics19. Deze op maat gemaakte biofilmen zullen het begrip van de principes van biofilm vorming en hun mechanische eigenschappen helpen, die verder onderzoek naar de mechanismen van antibiotische weerstand onder andere toepassingen toelaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol hier gepresenteerd voor 3D-afdrukken van gemanipuleerde biofilms heeft twee kritieke stappen. Eerst is de voorbereiding van de agar drukoppervlakte, die de meest kritieke factor aan het produceren van een specifieke druk resolutie is. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het drukoppervlak plat is en dat het pipet uiteinde op de printkop op de juiste hoogte van het oppervlak is geplaatst. Als de oppervlakte niet vlak is, zal de het werkafstand tijdens het drukproces veranderen. Als de werkafstand kleiner…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een AOARD toelage (nr. FA2386-18-1-4059), de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO/OCW) als onderdeel van de grenzen van het programma van de nanowetenschap, en het Advanced Materials NWO-NSFC programma (No. 729.001.016). De auteurs erkennen laboratorium hulp van Ramon van der Valk en Roland Kieffer.
Materials
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
