Modelage tridimensionnel de biofilms d’ingénierie avec une Bioimprimeur de bricolage
Summary
Cet article décrit une méthode de transformation d’une imprimante 3D commerciale à faible coût en une imprimante 3D bactérienne qui peut faciliter l’impression de biofilms à motifs. Tous les aspects nécessaires de la préparation du bioimprimeur et de la bio-encre sont décrits, ainsi que des méthodes de vérification pour évaluer la formation de biofilms.
Abstract
Les biofilms sont des agrégats de bactéries incorporées dans une matrice extracellulaire à motifs spatialement auto-produits. Les bactéries au sein d’un biofilm développent une résistance accrue aux antibiotiques, qui présente des dangers potentiels pour la santé, mais peuvent également être bénéfiques pour les applications environnementales telles que la purification de l’eau potable. Le développement ultérieur de thérapies antibactériennes et d’applications inspirées par le biofilm exigera le développement de méthodes reproductibles et ingéniables pour la création de biofilms. Récemment, une nouvelle méthode de préparation de biofilm utilisant une imprimante tridimensionnelle (3D) modifiée avec une encre bactérienne a été développée. Cet article décrit les étapes nécessaires à la construction de cette bio-imprimante 3D efficace et économique qui offre plusieurs applications dans le traitement des matériaux induits par les bactériotiques. Le protocole commence par une imprimante 3D commerciale adaptée dans laquelle l’extrudeuse a été remplacée par un distributeur d’encre bio relié à un système de pompe à seringue permettant un flux continu et contrôlable de bio-encre. Pour développer une bio-encre appropriée pour l’impression de biofilm, les bactéries d’ Escherichia coli modifiées ont été suspendues dans une solution d’alginate, de sorte qu’elles solidifient en contact avec une surface contenant du calcium. L’inclusion d’un produit chimique inducteur dans le substrat d’impression entraîne l’expression de protéines de biofilm dans la bio-encre imprimée. Cette méthode permet l’impression 3D de divers modèles spatiaux composés de couches discrètes de biofilms imprimés. Ces biofilms contrôlés spatialement peuvent servir de systèmes modèles et peuvent trouver des applications dans de multiples domaines qui ont un impact large sur la société, y compris la prévention de la résistance aux antibiotiques ou la purification de l’eau potable, entre autres.
Introduction
Il est actuellement de plus en plus nécessaire de développer des solutions respectueuses de l’environnement et durables pour la production de matériaux à motifs spatiaux, en raison du nombre croissant de marchés pour ces matériaux1. Cet article présente une méthode simple et économique pour la production de ces matériaux et offre donc un large éventail d’applications futures. La méthode présentée ici permet l’impression tridimensionnelle (3D) de structures spatialement modelés à l’aide d’une bio-encre contenant des bactéries vivantes. Les bactéries demeurent viables dans les structures imprimées pendant plus d’une semaine, ce qui permet aux bactéries d’effectuer des activités métaboliques naturelles ou machinées. Les bactéries imprimées peuvent ainsi produire et déposer les composants souhaités dans la structure imprimée, par exemple en créant un biofilm réticulé fonctionnel2.
Les méthodes traditionnelles de production de matériaux de pointe impliquent des dépenses énergétiques élevées (par exemple, des températures et/ou des pressions élevées) et peuvent produire de grandes quantités de déchets chimiques, souvent des substances toxiques nécessitant une utilisation extensive des coûts3 ,4. En revanche, plusieurs espèces bactériennes sont en mesure de produire des matériaux qui peuvent être facilement applicables dans diverses industries. Ces matériaux comprennent des polymères tels que les polyhydroxyalcanoates (PHA)5 ou poly (glycolide-co-lactide) (PGLA)6, la cellulose bactérienne7, les matériaux de béton bactérien8, les composites biomimétiques9, adhésifs à base d’amyloïdes10, ou des commutateurs électriques à base de bio11, entre autres. En outre, la production bactérienne de matériaux de valeur se déroule généralement à des températures et des pressions proches de l’environnement et dans des environnements aqueux, sans nécessiter ni produire de composés toxiques. Alors que la production de matériaux avec des bactéries a été démontrée dans la littérature et certaines applications industrielles ont déjà émergé12,13, une méthode fiable pour la structuration spatiale de ces matériaux reste un défi.
Cet article illustre une méthode simple de conversion d’une imprimante 3D commerciale à faible coût en une imprimante bactérienne 3D. Le protocole montre comment préparer une bio-encre contenant et soutenant les bactéries vivantes, ainsi que la façon de préparer des substrats sur lesquels l’impression 3D peut être effectuée. Cette méthode est appropriée à utiliser avec une variété de souches bactériennes naturelles et modifiées capables de produire des matériaux. Ces bactéries peuvent être réparties spatialement dans une structure imprimée en 3D et continuer leur activité métabolique, ce qui entraînera une distribution spatiale des matériaux désirés produits par les bactéries.
Cette méthode d’impression permet la fabrication additive de biofilms, d’agrégats de bactéries entourés d’une matrice extracellulaire autoproduite. Les biofilms sont des réseaux 3D hétérogènes dans lesquels les protéines, les polymères, les cellules bactériennes, l’oxygène et les nutriments sont tous spatialement structurés14. Sous la forme d’un biofilm, les bactéries présentent une résistance accrue aux antibiotiques et une robustesse structurelle, ce qui les rend difficiles à éradiquer des surfaces, y compris les cathéters médicaux et les implants. La clé des propriétés du biofilm, et aussi le plus grand défi pour la recherche sur le biofilm, semble être l’hétérogénéité des biofilms15,16,17. La production de biofilms modèles contrôlés spatialement est d’un intérêt particulier car elle permettrait de reproduire ou de régler les schémas spatiaux des composantes du biofilm, facilitant ainsi la compréhension du dépôt stable de biofilms sur pratiquement n’importe quelle surface dans nature.
Cet article présente une méthode pour la production de biofilms à l’aide d’hydrogels imprimés en 3D contenant des bactéries E. coli d’ingénierie qui produisent des protéines de biofilm en présence d’un inducteur, ainsi que des méthodes de vérification de la formation de biofilm2 . Les principaux composants de la matrice extracellulaire de ces biofilms sont les fibres amyloïdes18 qui contiennent des protéines CSGA auto-assemblées. Lorsque les bactéries E. coli sont induites pour exprimer des protéines CSGA, elles forment un biofilm modèle stable qui protège les cellules contre leur lavage hors de la surface d’impression. Un tel biofilm imprimé en 3D peut être contrôlé spatialement et peut servir d’outil de recherche utile pour l’investigation de la mécanique à plusieurs échelles de la structure de biofilm ou de la matériomique19. Ces biofilms sur mesure aideront à comprendre les principes de la formation des biofilms et leurs propriétés mécaniques, permettant ainsi de poursuivre la recherche sur les mécanismes de résistance aux antibiotiques entre autres applications.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici pour l’impression 3D de biofilms d’ingénierie a deux étapes critiques. La première est la préparation de la surface d’impression de gélose, qui est le facteur le plus critique pour produire une résolution d’impression spécifique. Il est important de s’assurer que la surface d’impression est plane et que la pointe de la pipette sur la tête de tête est positionnée à la bonne hauteur de la surface. Si la surface n’est pas plane, la distance de travail changera pendant le …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé par une subvention AOARD (no. FA2386-18-1-4059), l’Organisation néerlandaise de recherche scientifique (NWO/OCW) dans le cadre du programme frontières des nanosciences, et le programme des matériaux avancés NWO-NSFC (no 729.001.016). Les auteurs reconnaissent l’assistance en laboratoire de Ramon van der Valk et Roland Kieffer.
Materials
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
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