엔지니어 드 바이오 필름의 3 차원 패터 닝-it-스스로 바이오 필름

Summary

본 문서에서는 저가형 상업용 3D 프린터를 세균 3D 프린터로 변환 하 여 패턴화 된 바이오 필름의 인쇄를 촉진할 수 있는 방법을 설명 합니다. 바이오 필름 및 바이오 잉크를 제조 하는 데 필요한 모든 측면 뿐만 아니라 생물 막의 형성을 평가 하기 위한 검증 방법도 설명 합니다.

Abstract

바이오 필름은 자체 생산 된 공간적으로 패턴화 된 세포 외 기질에 내장 된 박테리아의 집합체 이다. 생물 막 내의 박테리아는 잠재적인 건강 위험을 제기 하는 향상 된 항 생 저항을 개발 합니다, 그러나 또한 식 수의 정화와 같은 환경 신청을 위해 유익할 수 있습니다. 항균 치료제 및 생물 막에서 영감을 얻은 응용 분야의 추가 개발은 생물 막 생성을 위한 재현 가능 하 고 공학 가능한 방법의 개발을 요구할 것입니다. 최근에는 세균 잉크로 수정 된 3 차원 (3d) 프린터를 이용한 바이오 필름 제제의 신규 한 방법이 개발 되 고 있다. 이 문서에서는 세균 유도 재료 처리에 여러 응용 프로그램을 제공 하는이 효율적이 고 저렴 한 3D 바이오 제약 업체를 구축 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜은 적용 가능한 상업용 3D 프린터로 시작 하 여 압출 기를 주사기 펌프 시스템에 연결 된 바이오 잉크 디스펜서로 교체한 후 제어 되 고 연속적인 바이오 잉크 흐름을 가능 하 게 합니다. 생물 막 인쇄에 적합 한 바이오 잉크를 개발 하기 위해, 조작 된 대장균 박테리아를 알지 네이트 용액에 현 탁 시킨 후, 이들이 칼슘을 함유한 표면과 접촉 하 여 응고 되도록 하였다. 인쇄 기판 내에 유도 화학 물질의 포함은 인쇄 된 바이오 잉크 내에서 생물 막 단백질의 발현을 구동 한다. 이 방법을 사용 하면 인쇄 된 바이오 필름의 개별 레이어로 구성 된 다양 한 공간 패턴의 3D 인쇄가 가능 합니다. 이러한 공간적으로 제어 되는 생물 막은 모델 시스템의 역할을 할 수 있으며, 항생제 내성 예방 또는 음 용 수 정화 등 사회에 광범위 한 영향을 미치는 여러 분야의 응용 분야를 찾을 수 있습니다.

Introduction

현재 이러한 물질의 시장 수가 증가 함에 따라 공간적으로 패턴화 된 재료의 생산을 위한 친환경적이 고 지속 가능한 솔루션을 개발 해야 하는 필요성이 커지고 있다¹. 이 문서는 이러한 재료의 생산을 위한 간단 하 고 경제적인 방법을 제시 하 고, 따라서 미래의 응용 프로그램의 큰 스펙트럼을 제공 합니다. 여기에 제시 된 방법은 살아있는 박테리아를 포함 하는 바이오 잉크를 사용 하 여 공간적으로 패턴 된 구조의 3 차원 (3d) 인쇄를 허용 한다. 박테리아는 자연 또는 공학적 된 신진 대사 활동을 수행 하는 박테리아를 가능 하 게 1 주일 이상 인쇄 된 구조 내에서 가능한 남아. 인쇄 된 박테리아는 예를 들어 기능적 가교 된 생물 막²를 생성 하 여 인쇄 된 구조 내에서 원하는 성분을 생성 하 고 침전 시킬 수 있다.

첨단 소재 생산을 위한 전통적인 방법에는 높은 에너지 지출 (예: 고온 및/또는 압력)이 포함 되며 대량의 화학 폐기물을 생산할 수 있으며, 종종 비용-광범위 한 활용도가 요구 되는 독성 물질을 생산 합니다.^{3 ,4}. 대조적으로, 여러 세균 종은 다양 한 산업에서 쉽게 적용 할 수 있는 물질을 생산할 수 있다. 이들 물질은 폴 리 하이드 록 시 알 카 네이트 (PHA)⁵ 또는 폴 리아 (락 티 드)⁶의 세균 셀 룰로 오 스⁷, 세균 콘크리트 물질⁸, 생물 모방 복합 재⁹와 같은 중합체를 포함 하며, 아 밀 로이드 계 접착제¹⁰또는 바이오 기반 전기 스위치 (¹¹)는 그 중 에서도. 더욱이, 귀중 한 물질의 세균 생산은 일반적으로 독성 화합물을 요구 하거나 생산 하지 않고 주변 온도와 압력 및 수성 환경에서 일어난다. 박테리아로 재료를 생산 하는 것은 문헌에서 입증 되었지만 일부 산업 응용 분야는 이미^12,13, 이러한 물질의 공간적 패터 닝을 위한 신뢰할 수 있는 방법은 여전히 과제로 남아 있다.

이 문서에서는 저비용 상업용 3D 프린터를 3D 세균 프린터로 변환 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 살아있는 세균을 함유 하 고 유지 하는 바이오 잉크를 제조 하는 방법 뿐만 아니라, 3D 프린팅이 수행 될 수 있는 기판을 준비 하는 방법을 보여준다. 이 방법은 재료를 생산할 수 있는 다양 한 천연 및 공학적 세균 균 주와 함께 사용 하는 것이 적절 하다. 이러한 박테리아는 공간적으로 3D 프린팅 된 구조 내에서 분산 될 수 있고, 여전히 그들의 대사 활성을 계속 하며,이는 박테리아에 의해 생성 된 원하는 물질의 공간적 분포를 초래할 것 이다.

이 인쇄 방법은 자체 생산 된 세포 외 기질로 둘러싸인 생물 막, 세균 응집 체의 적 층 제조를 가능 하 게 한다. 바이오 필름은 단백질, 폴리머, 박테리아 세포, 산소 및 영양분이 모두 공간적으로 구조화 된 이종 3D 네트워크입니다. 생물 막의 형태로, 박테리아는 증가 된 항생제 저항과 구조적 견고성을 나타내며, 의료용 카 테 터 및 임 플 란 트를 포함 한 표면에서 근절 하기 어렵게 합니다. 생물 막 특성에 대 한 핵심은 생물 막 연구에도 가장 큰 과제 이며, 바이오 필름^15,16,17의 이질성 일 것으로 보인다. 공간적으로 제어 되는 모델의 바이오 필름의 생산은 생물 막 성분의 공간적 패턴을 재생 하거나 조정 하는 것을 허용 하 고, 사실상 모든 표면에서 생물 막의 안정적인 침착에 대 한 이해를 돕는 것과 같은 특별 한 관심을가지고 있습니다. 자연.

이 기사는 바이오 필름 형성의 검증 방법 뿐만 아니라 유도 체의 존재 하에 바이오 필름 단백질을 생산 하는 엔지니어링 된 대장균 박테리아를 포함 하는 3d 프린팅 하이드로 젤을 사용 하는 바이오 필름의 제조 방법을 제시 합니다.² . 이들 바이오 필름의 주요 세포 외 기질 성분은 자가 조립 된 CsgA 단백질을 함유 하는 curli 아 밀 로이드 섬유 (¹⁸ ) 이다. 개발 된 대장균 박테리아가 csga 단백질을 발현 하도록 유도 되 면, 이들은 인쇄 표면에서 씻 겨 지는 세포를 보호 하는 생물 막의 안정한 모델을 형성 한다. 이러한 3D 프린팅 생물 막은 공간적으로 제어 될 수 있고 다중 스케일 생물 막 구조 기능 역학 또는 물질 들 (¹⁹)의 조사를 위한 유용한 연구 도구로 서 작용할 수 있다. 이러한 맞춤형 바이오 필름은 바이오 필름 형성과 기계적 특성의 원리에 대 한 이해를 돕고, 다른 응용 프로그램 들 사이에서 항 생 저항의 메커니즘에 대 한 추가 연구를 가능 하 게 합니다.

Protocol

1. 상업용 3D 프린터를 3D 바이오 제약으로 변환 프린터 프레임에서 상업용 3D 프린터 (재질 테이블)의 압출 기와 히터를 분리 하 고 메인 회로 기판에서 이러한 요소를 제어 하는 배선을 분리 합니다 (그림 1a). 프린터의 작동 온도를 제어 하는 센서가 프린터 소프트웨어와 통신 하기 위해 작동 해야 하므로, 인쇄 소프트웨어에서 작동 온도에 도달할 때까지 ?…

Representative Results

바이오 필름의 성공적인 3D 프린팅에 대 한 첫 번째 단계는 상업용 3D 프린터를 바이오 필름으로 변환 하는 것입니다. 이 변환은 폴리머 잉크로 인쇄 하도록 설계 된 프린터의 압출 기와 히터를 제거 하 고 살아있는 박테리아를 포함 하는 바이오 잉크를 인쇄 하는 데 적합 한 구성 요소로 대체 함으로써 달성 됩니다 (그림 1a). 압출 기는 주사기 펌프에 ?…

Discussion

엔지니어링 된 바이오 필름의 3D 프린팅을 위해 여기에 제시 된 프로토콜은 두 가지 중요 한 단계를가지고 있습니다. 첫 번째는 특정 인쇄 해상도를 생산 하는 가장 중요 한 요인이 되는 한 천 인쇄 면의 준비입니다. 인쇄 표면이 평평 하 고 프린트 헤드의 피 펫 팁이 표면에서 올바른 높이로 배치 되었는지 확인 하는 것이 중요 합니다. 표면이 평평 하지 않으면 인쇄 과정에서 작동 거리가 변경 됩?…

Materials

3D printer	CoLiDo	3D-P Kit
3D printing software	CoLiDo	Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar	Sigma-Aldrich	05040
CaCl2 dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	3886.1
LB broth powder	Sigma-Aldrich	L3022
Orbital shaker	VWR	89032-092	Model 3500
Petri dish	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Silicon tubing	VWR	DENE 3100103/25
Syringe pump	ProSense B.V.	NE-300
Sodium alginate	Sigma-Aldrich	W201502
Sodium citrate monobasic	Sigma-Aldrich	71498
Sodium hydrooxide	VWR	28244.295