El patrón tridimensional de biofilms de ingeniería con un Bioprinter hágalo usted mismo
Summary
Este artículo describe un método para transformar una impresora 3D comercial de bajo costo en una impresora 3D bacteriana que puede facilitar la impresión de biofilms estampados. Se describen todos los aspectos necesarios de la preparación del bioprintro y la bio-tinta, así como los métodos de verificación para evaluar la formación de biofilms.
Abstract
Los biofilms son agregados de bacterias incrustadas en una matriz extracelular de patrón espacialmente autoproducida. Las bacterias dentro de un biofilm desarrollan una mayor resistencia a los antibióticos, lo que plantea posibles peligros para la salud, pero también puede ser beneficioso para aplicaciones ambientales como la purificación del agua potable. El desarrollo ulterior de terapias antibacterianas y aplicaciones inspiradas en biofilm requerirá el desarrollo de métodos reproducibles e ingenierables para la creación de biopelículas. Recientemente, se ha desarrollado un novedoso método de preparación de biofilm utilizando una impresora tridimensional (3D) modificada con una tinta bacteriana. Este artículo describe los pasos necesarios para construir este biofrintro 3D eficiente y de bajo costo que ofrece múltiples aplicaciones en el procesamiento de materiales inducidos por bacterialmente. El protocolo comienza con una impresora 3D comercial adaptada en la que la extrusora ha sido reemplazada por un dispensador de bio-tinta conectado a un sistema de bomba de jeringa que permite un flujo controlable y continuo de bio-tinta. Para desarrollar una tinta biológica adecuada para la impresión de biofilm, las bacterias de Escherichia coli diseñadas se suspendieron en una solución de alginato, de modo que se solidifican en contacto con una superficie que contiene calcio. La inclusión de un producto químico inductor dentro del sustrato de impresión impulsa la expresión de las proteínas de biofilm dentro de la tinta bio impresa. Este método permite la impresión 3D de varios patrones espaciales compuestos por capas discretas de biofilms impresos. Estos biofilms controlados espacialmente pueden servir como sistemas modelo y pueden encontrar aplicaciones en múltiples campos que tienen un gran impacto en la sociedad, incluyendo la prevención de resistencia a los antibióticos o la purificación del agua potable, entre otros.
Introduction
Actualmente existe una creciente necesidad de desarrollar soluciones sostenibles y respetuosas con el medio ambiente para la producción de materiales con patrones espacialmente, debido al creciente número de mercados para dichos materiales1. Este artículo presenta un método sencillo y económico para la producción de estos materiales y, por lo tanto, ofrece un amplio espectro de aplicaciones futuras. El método que se presenta aquí permite la impresión tridimensional (3D) de estructuras con patrones espacialmente utilizando un bio-Ink que contiene bacterias vivas. Las bacterias permanecen viables dentro de las estructuras impresas durante más de una semana, lo que permite a las bacterias realizar actividades metabólicas naturales o diseñadas. Por lo tanto, las bacterias impresas pueden producir y depositar los componentes deseados dentro de la estructura impresa, por ejemplo, creando un biofilm cruzado funcional2.
Los métodos tradicionales para la producción de materiales avanzados implican gastos de alta energía (por ejemplo, altas temperaturas y/o presiones) y pueden producir grandes cantidades de desechos químicos, a menudo sustancias tóxicas que requieren una utilización de gran costo3 ,4. En contraste, múltiples especies bacterianas son capaces de producir materiales que pueden ser fácilmente aplicables en diversas industrias. Estos materiales incluyen polímeros tales como polihidroxialcananatos (PHA)5 o poli (glicolide-Co-lactida) (PGLA)6, celulosa bacteriana7, materiales de hormigón bacteriano8, compuestos biomiméticos9, adhesivos a base de amiloides10, o interruptores eléctricos de base biológica11, entre otros. Por otra parte, la producción bacteriana de materiales valiosos normalmente tiene lugar a temperaturas y presiones casi ambientales y en ambientes acuosos, sin necesidad de producir compuestos tóxicos. Mientras que la producción de materiales con bacterias se ha demostrado en la literatura y algunas aplicaciones industriales ya han surgido12,13, un método confiable para el patrón espacial de estos materiales sigue siendo un desafío.
Este artículo muestra un método sencillo de convertir una impresora 3D comercial de bajo costo en una impresora bacteriana 3D. El protocolo muestra cómo preparar una bio-tinta que contiene y sostener las bacterias vivas, así como la forma de preparar sustratos sobre los que se puede realizar la impresión 3D. Este método es apropiado para usar con una variedad de cepas bacterianas naturales y diseñadas capaces de producir materiales. Estas bacterias pueden distribuirse espacialmente dentro de una estructura impresa en 3D y continuar con su actividad metabólica, lo que resultará en una distribución espacial de los materiales deseados producidos por las bacterias.
Este método de impresión permite la fabricación aditiva de biofilms, agregados de bacterias rodeadas por una matriz extracelular autoproducida. Las biofilms son redes 3D heterogéneas en las que las proteínas, los polímeros, las células bacterianas, el oxígeno y los nutrientes se estructuran espacialmente14. Mientras que en la forma de un biofilm, las bacterias exhiben una mayor resistencia a los antibióticos y robustez estructural, haciéndolos difíciles de erradicar de las superficies incluyendo catéteres médicos e implantes. La clave de las propiedades de biofilm, y también el mayor desafío a la investigación de biofilm, parece ser la heterogeneidad de biofilms15,16,17. La producción de biofilms de modelo controlados espacialmente es de especial interés, ya que permitiría reproducir o ajustar los patrones espaciales de los componentes de biofilm, ayudando a la comprensión de la deposición estable de biofilms en prácticamente cualquier superficie en naturaleza.
Este artículo presenta un método para la producción de biofilms utilizando hidrogeles impresos en 3D que contienen bacterias de E. coli diseñadas que producen proteínas de biofilm en presencia de un inductor, así como métodos de verificación de la formación de biofilm2 . Los principales componentes de la matriz extracelular de estos biofilms son las fibras de curli amiloide18 que contienen proteínas csga autoensambladas. Cuando las bacterias de E. coli diseñadas se inducen a expresar proteínas csga, forman un biofilm modelo estable que protege las células contra ser lavado fuera de la superficie de impresión. Este biofilm impreso en 3D puede controlarse espacialmente y puede servir como una herramienta de investigación útil para la investigación de la estructura de biofilm multiescala-mecánica de función o materiómica19. Estos biofilms personalizados ayudarán a la comprensión de los principios de la formación de biofilm y sus propiedades mecánicas, permitiendo una mayor investigación sobre los mecanismos de resistencia a los antibióticos entre otras aplicaciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado aquí para la impresión 3D de biofilms de ingeniería tiene dos pasos críticos. En primer lugar, la preparación de la superficie de impresión de agar, que es el factor más crítico para producir una resolución de impresión específica. Es importante asegurarse de que la superficie de impresión sea plana y de que la punta de la Piera del cabezal esté colocada a la altura correcta de la superficie. Si la superficie no es plana, la distancia de trabajo cambiará durante el proceso de impresi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención AOARD (no. FA2386-18-1-4059), la Organización Neerlandesa de investigación científica (NWO/OCW) como parte del programa Frontiers of Nanoscience, y el programa de materiales avanzados NWO-NSFC (núm. 729.001.016). Los autores reconocen la asistencia de laboratorio de Ramon van der Valk y Roland Kieffer.
Materials
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
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