Padronização tridimensional de biofilmes projetados com uma Bioimpressora do-it-yourself
Summary
Este artigo descreve um método de transformar uma impressora 3D comercial de baixo custo em uma impressora 3D bacteriana que pode facilitar a impressão de biofilmes padronizados. Todos os aspectos necessários da preparação da bioimpressora e da biostinta são descritos, bem como métodos de verificação para avaliar a formação de biofilmes.
Abstract
Biofilmes são agregados de bactérias incorporadas em uma matriz extracelular autoproduzida espacialmente padronizada. As bactérias dentro de um biofilme desenvolvem a resistência antibiótica aumentada, que levanta perigos potenciais da saúde, mas podem igualmente ser benéficas para aplicações ambientais tais como a purificação da água bebendo. O desenvolvimento de terapias antibacterianas e aplicações inspiradas no biofilme exigirá o desenvolvimento de métodos reprodutíveis e engeneráveis para a criação de biofilme. Recentemente, um novo método de preparação de biofilme usando uma impressora tridimensional modificada (3D) com uma tinta bacteriana foi desenvolvido. Este artigo descreve as etapas necessárias para criar essa bioimpressora 3D eficiente e de baixo custo que oferece várias aplicações em processamento de materiais induzido por bacterialmente. O protocolo começa com uma impressora 3D comercial adaptada em que a extrusora foi substituída por um dispensador de bio-tinta conectado a um sistema de bomba de seringa que permite um fluxo controlável e contínuo de biotinta. Para desenvolver uma bio-tinta apropriada para a impressão do biofilme, as bactérias projetadas de Escherichia coli foram suspendidas em uma solução do alginate, de modo que solidificar no contato com uma superfície que contem o cálcio. A inclusão de um indutor químico dentro do substrato de impressão impulsiona a expressão de proteínas de biofilme dentro da biotinta impressa. Este método permite a impressão 3D de vários padrões espaciais compostos de camadas discretas de biofilmes impressos. Tais biofilmes espacialmente controlados podem servir como sistemas modelo e podem encontrar aplicações em vários campos que têm um amplo impacto na sociedade, incluindo a prevenção de resistência a antibióticos ou a purificação de água potável, entre outros.
Introduction
Atualmente, há uma necessidade crescente de desenvolver soluções sustentáveis e ambientalmente amigáveis para a produção de materiais com padrões espaciais, devido ao número crescente de mercados para esses materiais1. Este artigo apresenta um método simples e econômico para a produção de tais materiais e, portanto, oferece um grande espectro de aplicações futuras. O método apresentado aqui permite a impressão tridimensional (3D) de estruturas espacialmente padronizadas usando uma bio-tinta contendo bactérias vivas. As bactérias permanecem viáveis dentro das estruturas impressas por mais de uma semana, permitindo que as bactérias realizem atividades metabólicas naturais ou projetadas. As bactérias impressas podem, assim, produzir e depositar os componentes desejados dentro da estrutura impressa, por exemplo, criando um biofilme funcional reticulado2.
Os métodos tradicionais para a produção de materiais avançados envolvem gastos de alta energia (por exemplo, altas temperaturas e/ou pressões) e podem produzir grandes quantidades de resíduos químicos, muitas vezes substâncias tóxicas que necessitam de custo-utilização extensiva3 ,4. Em contraste, várias espécies bacterianas são capazes de produzir materiais que podem ser prontamente aplicáveis em várias indústrias. Estes materiais incluem polímeros como polihidroxialcananoatos (PHA)5 ou poli (glycolide-co-lactide) (pgla)6, celulose bacteriana7, materiais concretos bacterianos8, compósitos Biomiméticos9, adesivos baseados em amiloide10, ou interruptores elétricos baseados em bio11, entre outros. Além disso, a produção bacteriana de materiais valiosos ocorre tipicamente em temperaturas e pressões Near-Ambient e em ambientes aquosos, sem exigir ou produzir compostos tóxicos. Enquanto a produção de materiais com bactérias tem sido demonstrada na literatura e algumas aplicações industriais já surgiram12,13, um método confiável para padronização espacial de tais materiais continua a ser um desafio.
Este artigo demonstra um método direto para converter uma impressora 3D comercial de baixo custo em uma impressora bacteriana 3D. O protocolo mostra como preparar uma bio-tinta contendo e sustentar as bactérias vivas, bem como a forma de preparar substratos para o qual a impressão 3D pode ser realizada. Este método é apropriado usar-se com uma variedade de tensões bacterianas naturais e projetadas capazes de produzir materiais. Essas bactérias podem ser distribuídas espacialmente dentro de uma estrutura impressa em 3D e ainda continuar sua atividade metabólica, o que resultará em uma distribuição espacial dos materiais desejados produzidos pelas bactérias.
Este método de impressão permite a fabricação aditiva de biofilmes, agregados de bactérias cercadas por uma matriz extracelular autoproduzida. Os biofilmes são redes 3D heterogêneas nas quais proteínas, polímeros, células bacterianas, oxigênio e nutrientes são todos espacialmente estruturados14. Enquanto na forma de um biofilme, as bactérias exibem um aumento da resistência aos antibióticos e robustez estrutural, tornando-os difíceis de erradicar a partir de superfícies, incluindo cateteres médicos e implantes. A chave para as propriedades de biofilme, e também o maior desafio para a pesquisa de biofilme, parece ser a heterogeneidade dos biocombustíveis15,16,17. A produção de biofilmes modelo espacialmente controlados é de interesse especial, pois permitiria reproduzir ou ajustar os padrões espaciais dos componentes do biofilme, auxiliando na compreensão da deposição estável de Biofilo em praticamente qualquer superfície em Natureza.
Este artigo apresenta um método para a produção de biofilmes utilizando hidrogéis impressos em 3D contendo bactérias de E. coli projetadas que produzem proteínas de biofilme na presença de um indutor, bem como métodos de verificação da formação de biofilme2 . Os principais componentes da matriz extracelular desses biofilmes são as fibras amilóides de cabelo18 que contêm proteínas csga automontadas. Quando as bactérias projetadas de E. coli são induzidas para expressar proteínas de csga, formam um biofilme modelo estável que proteja as pilhas de encontro a ser lavado fora da superfície de impressão. Tal biofilme impresso em 3D pode ser controlado espacialmente e pode servir como uma ferramenta de pesquisa útil para a investigação da mecânica de função de estrutura de biofilme multiescala ou chamado19. Esses biofilmes medida auxiliarão na compreensão dos princípios da formação de biofilme e suas propriedades mecânicas, possibilitando mais pesquisas sobre os mecanismos de resistência aos antibióticos entre outras aplicações.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado aqui para a impressão 3D de biofilmes projetados tem duas etapas críticas. Primeiro é a preparação da superfície de impressão em ágar, que é o fator mais crítico para a produção de uma resolução de impressão específica. É importante garantir que a superfície de impressão é plana e que a ponta da pipeta na cabeça de cabeça é posicionada na altura correta da superfície. Se a superfície não for plana, a distância de trabalho mudará durante o processo de impressão. Se a di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção AOARD (no. FA2386-18-1-4059), a organização neerlandesa de investigação científica (NWO/OCW) como parte do programa fronteiras de Nanoscience, e o programa de materiais avançados NWO-NSFC (no. 729.001.016). Os autores reconhecem a assistência laboratorial de Ramon Van der Valk e Roland Kieffer.
Materials
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
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