Tredimensionelt mønster af konstruerede Biofilms med en gør-det-selv Bioprinter
Summary
Denne artikel beskriver en metode til at omdanne en lavpris-kommerciel 3D-printer til en bakteriel 3D-printer, der kan lette udskrivningen af mønstrede biofilm. Alle nødvendige aspekter af forberedelsen af bioprinter og bio-Ink er beskrevet, samt verifikation metoder til at vurdere dannelsen af biofilms.
Abstract
Biofilms er aggregater af bakterier indlejret i en selv produceret rumligt-mønstrede ekstracellulære matrix. Bakterier i en biofilm udvikle øget antibiotikaresistens, som udgør potentielle sundhedsmæssige farer, men kan også være gavnlig for miljømæssige anvendelser såsom rensning af drikkevand. Den videre udvikling af antibakteriel terapi og biofilm-inspirerede applikationer vil kræve udvikling af reproducerbare, engineerable metoder til biofilm skabelse. For nylig, en ny metode til biofilm forberedelse ved hjælp af en modificeret tredimensionel (3D) printer med en bakteriel blæk er blevet udviklet. I denne artikel beskrives de trin, der er nødvendige for at opbygge denne effektive, billige 3D-bioprinter, der tilbyder flere applikationer i bakterielt induceret materialebehandling. Protokollen begynder med en tilpasset kommerciel 3D-printer, hvor ekstruder er blevet erstattet med en bio-blæk dispenser tilsluttet en sprøjtepumpe system muliggør en kontrollerbar, kontinuerlig strøm af bio-blæk. For at udvikle en bio-blæk egnet til biofilm trykning, manipuleret Escherichia coli bakterier blev suspenderet i en opløsning af alginat, så de størkner i kontakt med en overflade, der indeholder calcium. Medtagelsen af et induktor kemikalie i tryk substratet driver ekspression af biofilm proteiner inden for det trykte bio-Ink. Denne metode muliggør 3D-printning af forskellige rummønstre bestående af diskrete lag af trykte biofilm. Sådanne rumlige-kontrollerede biofilm kan tjene som modelsystemer og kan finde applikationer i flere områder, der har en vidtrækkende indvirkning på samfundet, herunder antibiotikaresistens forebyggelse eller drikkevand rensning, blandt andre.
Introduction
Der er i øjeblikket et stigende behov for at udvikle miljøvenlige, bæredygtige løsninger til fremstilling af rumligt mønstrede materialer på grund af det voksende antal markeder for sådanne materialer1. Denne artikel præsenterer en enkel, økonomisk metode til produktion af sådanne materialer og tilbyder derfor et stort spektrum af fremtidige applikationer. Den metode, der præsenteres her tillader tredimensionel (3D) trykning af rumligt mønstrede strukturer ved hjælp af en bio-blæk, der indeholder levende bakterier. Bakterier forbliver levedygtige inden for de trykte strukturer i over en uge, så bakterierne til at udføre naturlige eller manipuleret metaboliske aktiviteter. Trykte bakterier kan derved producere og deponere ønskede komponenter inden for den trykte struktur, for eksempel at skabe en funktionel Cross-linked biofilm2.
Traditionelle metoder til fremstilling af avancerede materialer indebærer høje energiudgifter (f. eks. høje temperaturer og/eller belastninger) og kan producere store mængder kemisk affald, ofte giftige stoffer, der kræver omkostnings omfattende udnyttelse3 ,4. I modsætning hertil er flere bakteriearter i stand til at producere materialer, der let kan anvendes i forskellige brancher. Disse materialer omfatter polymerer såsom polyhydroxyalkanoates (PHA)5 eller poly (glycolid-Co-lactide) (pgla)6, bakteriel cellulose7, bakterielle beton materialer8, biomimetiske kompositter9, amyloid-baserede klæbemidler10, eller bio-baserede elektriske afbrydere11, blandt andre. Desuden, bakteriel produktion af værdifulde materialer typisk finder sted ved nær omgivende temperaturer og tryk og i vandige miljøer, uden at kræve eller producerer giftige forbindelser. Mens producere materialer med bakterier er blevet påvist i litteraturen og nogle industrielle anvendelser er allerede dukket12,13, en pålidelig metode til rumlig mønster af sådanne materialer er fortsat en udfordring.
Denne artikel demonstrerer en lineær metode til konvertering af en billig kommerciel 3D-printer til en 3D-bakteriel printer. Protokollen viser, hvordan man forbereder en bio-blæk, der indeholder og opretholder de levende bakterier, samt hvordan man forbereder substrater, som 3D-printning kan udføres. Denne metode er velegnet til brug med en række naturlige og konstruerede bakteriestammer i stand til at producere materialer. Disse bakterier kan fordeles rumligt inden for en 3D trykt struktur og stadig fortsætte deres metaboliske aktivitet, hvilket vil resultere i en rumlig fordeling af de ønskede materialer, der produceres af bakterierne.
Denne udskrivningsmetode muliggør additiv fremstilling af biofilm, aggregater af bakterier omgivet af en selv produceret ekstracellulær matrix. Biofilms er heterogene 3D netværk, hvor proteiner, polymerer, bakterieceller, ilt, og næringsstoffer er alle rumligt struktureret14. Mens bakterier i form af en biofilm, udviser en øget antibiotikaresistens og strukturel robusthed, hvilket gør dem svære at udrydde fra overflader, herunder medicinske katetre og implantater. Nøglen til biofilm egenskaber, og også den største udfordring til biofilm forskning, synes at være heterogenitet biofilm15,16,17. Produktion af rumligt styrede biofilm er af særlig interesse, da den vil gøre det muligt enten at gengive eller justere de rumlige mønstre af biofilm komponenter, at bidrage til forståelsen af den stabile afsætning af biofilm på stort set alle overflader i Natur.
Denne artikel præsenterer en metode til produktion af biofilm ved hjælp af 3D-trykte hydrogel indeholdende konstruerede E. coli bakterier, der producerer biofilm proteiner i tilstedeværelse af en inducer, samt metoder til verifikation af biofilm dannelse2 . De store ekstracellulære matrixkomponenter i disse biofilm er curli amyloid fibre18 , der indeholder selv monterede csga-proteiner. Når manipuleret E. coli bakterier er induceret til at udtrykke csga proteiner, de danner en stabil model biofilm, der beskytter cellerne mod at blive vasket ud af trykning overflade. En sådan 3D trykt biofilm kan rummæssigt styres og kan tjene som et nyttigt forskningsværktøj til undersøgelse af multi skala biofilm struktur-funktion mekanik eller materiomics19. Disse skræddersyede biofilm vil støtte forståelsen af principperne for biofilm dannelse og deres mekaniske egenskaber, der muliggør yderligere forskning i mekanismerne for antibiotikaresistens blandt andre applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den protokol, der her præsenteres for 3D-printning af konstruerede biofilm, har to kritiske trin. Først er forberedelsen af agar trykning overflade, som er den mest kritiske faktor til at producere en bestemt trykning opløsning. Det er vigtigt at sikre, at tryk overfladen er flad, og at pipettespidsen på skrivehovedet er placeret i den korrekte højde fra overfladen. Hvis overfladen ikke er flad, vil arbejds distancen ændre under udskrivningsprocessen. Hvis arbejdsafstanden er mindre end 0,1 mm, kan CaCl2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et AOARD-tilskud (nr. FA2386-18-1-4059), den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO/OCW) som en del af grænserne for Nanoscience-programmet, og Advanced Materials NWO-NSFC-programmet (nr. 729.001.016). Forfatterne anerkender den laboratorie hjælp, som Ramon van der Valk og Roland Kieffer har.
Materials
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
