Tredimensjonale mønstre av konstruert biofilm med en gjør-det-selv-Bioprinter
Summary
Denne artikkelen beskriver en metode for å transformere en lavprisalternativ kommersiell 3D-skriver til en bakteriell 3D-skriver som kan forenkle utskrift av mønstrede biofilm. Alle nødvendige aspekter ved utarbeidelse av bioprinter og bio-blekk er beskrevet, samt verifikasjon metoder for å vurdere dannelsen av biofilm.
Abstract
Biofilm er aggregater av bakterier innebygd i en selv-produsert romlig-mønstret ekstracellulære matrise. Bakterier i en biofilm utvikle forbedret antibiotikaresistens, som utgjør potensielle helsemessige farer, men kan også være gunstig for miljø applikasjoner som rensing av drikkevann. Den videre utviklingen av anti-bakterielle legemiddel-og biofilm-inspirerte anvendelser vil kreve utvikling av reproduserbar, engineerable metoder for biofilm skapelse. Nylig er en ny metode for biofilm forberedelser ved hjelp av en modifisert tredimensjonal (3D) skriver med en bakteriell blekk er utviklet. Denne artikkelen beskriver fremgangsmåten som er nødvendig for å bygge denne effektive, rimelige 3D-bioprinter som tilbyr flere applikasjoner i bacterially materialbehandling. Protokollen begynner med en tilpasset kommersiell 3D-skriver der Ekstruder er erstattet med en bio-blekk dispenser koblet til et sprøyte pumpesystem som muliggjør en kontrollerbar, kontinuerlig strøm av bio-blekk. For å utvikle en bio-blekk egnet for biofilm utskrift, konstruert Escherichia coli bakterier ble suspendert i en løsning av alginat, slik at de stivner i kontakt med en overflate som inneholder kalsium. Inkluderingen av en induser kjemisk innen utskrift underlaget driver uttrykk for biofilm proteiner innenfor den trykte bio-blekk. Denne metoden muliggjør 3D-utskrift av ulike romlige mønstre som består av diskrete lag med trykte biofilm. Slike romlig-kontrollerte biofilm kan tjene som modellsystemer og kan finne programmer i flere felt som har en omfattende innvirkning på samfunnet, inkludert antibiotikaresistens forebygging eller drikkevann rensing, blant andre.
Introduction
Det er i dag et økende behov for å utvikle miljøvennlige, bærekraftige løsninger for produksjon av romlig-mønstrede materialer, på grunn av det voksende antall markeder for slikt materiale1. Denne artikkelen presenterer en enkel, økonomisk metode for produksjon av slike materialer, og derfor tilbyr et stort spekter av fremtidige applikasjoner. Metoden som presenteres her tillater tredimensjonal (3D) utskrift av romlig-mønstret strukturer ved hjelp av en bio-blekk som inneholder levende bakterier. Bakterier fortsatt levedyktig innenfor trykte strukturer i over en uke, slik at bakteriene til å utføre naturlige eller konstruerte metabolske aktiviteter. Trykte bakterier kan dermed produsere og sette inn ønskede komponenter i den trykte strukturen, for eksempel å skape en funksjonell tverrbundet biofilm2.
Tradisjonelle metoder for produksjon av avanserte materialer involverer høy energi utgifter (f. eks, høye temperaturer og/eller trykk) og kan produsere store mengder kjemisk avfall, ofte giftige stoffer som krever kostnads omfattende utnyttelse3 ,4. I kontrast, flere bakterielle arter er i stand til å produsere materialer som kan lett brukes i ulike bransjer. Disse materialene omfatter polymerer som polyhydroxyalkanoates (PHA)5 eller Poly (glykolid-co-laktid) (PGLA)6, bakteriell cellulose7, bakterielle betong materialer8, BioMimetic kompositter9, amyloid-baserte lim10, eller bio-baserte elektriske brytere11, blant andre. Dessuten, bakteriell produksjon av verdifulle materialer vanligvis finner sted på nær omgivelsestemperaturer og trykk og i vandige miljøer, uten å kreve eller produsere giftige forbindelser. Mens produsere materialer med bakterier har blitt demonstrert i litteraturen og noen industrielle anvendelser har allerede dukket opp12,13, en pålitelig metode for romlig mønstre av slikt materiale er fortsatt en utfordring.
Denne artikkelen demonstrerer en rett fram metode for å konvertere en lavprisalternativ kommersiell 3D-skriver til en 3D-bakteriell skriver. Protokollen viser hvordan man forbereder en bio-blekk som inneholder og opprettholde den levende bakterier, samt hvordan å forberede underlag som 3D-utskrift kan utføres. Denne metoden er hensiktsmessig å bruke med en rekke naturlige og konstruerte bakterielle stammer i stand til å produsere materialer. Disse bakteriene kan være romlig fordelt i en 3D trykt struktur og likevel fortsette sin metabolske aktivitet, noe som vil resultere i en romlig fordeling av de ønskede materialer produsert av bakterier.
Denne utskriftsmetoden muliggjør additiv produksjon av biofilm, aggregater av bakterier omgitt av en selv-produsert ekstracellulære matrise. Biofilm er heterogene 3D-nettverk der proteiner, polymerer, bakterielle celler, oksygen og næringsstoffer er alle romlig strukturert14. Selv i form av en biofilm, bakterier viser en økt antibiotikaresistens og strukturell robusthet, noe som gjør dem vanskelige å utrydde fra overflater, inkludert medisinske katetre og implantater. Nøkkelen til biofilm egenskaper, og også den største utfordringen til biofilm forskning, synes å være heterogenitet av biofilm15,16,17. Produksjon av romlig modell biofilm er av spesiell interesse som det ville tillate enten reprodusere eller tuning den romlige mønstre av biofilm komponenter, hjelpe forståelsen av stabile deponering av biofilm på nesten alle overflater i Natur.
Denne artikkelen presenterer en metode for produksjon av biofilm ved hjelp av 3D-trykte hydrogeler inneholder konstruert E. coli bakterier som produserer biofilm proteiner i nærvær av en induser, samt metoder for verifisering av biofilm formasjon2 . De store ekstracellulære Matrix komponenter av disse biofilm er curli amyloid fibre18 som inneholder selv-monterte CsgA proteiner. Når konstruert E. coli bakterier er indusert å uttrykke CsgA proteiner, danner de en stabil modell biofilm som beskytter cellene mot å bli vasket ut av utskriftsflaten. En slik 3D trykt biofilm kan være romlig kontrollert og kan tjene som et nyttig forskningsverktøy for etterforskningen av multiscale biofilm struktur-funksjon mekanikk eller materiomics19. Disse skreddersydde biofilm vil hjelpe forståelsen av prinsippene for biofilm dannelse og deres mekaniske egenskaper, slik at videre forskning på mekanismer for antibiotikaresistens blant andre applikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som presenteres her for 3D-utskrift av konstruerte biofilm har to kritiske trinn. Først er utarbeidelse av agar utskrift overflaten, som er den mest kritiske faktoren for å produsere en bestemt utskriftsoppløsning. Det er viktig å sørge for at utskriftsflaten er flat og at pipette spissen på skrivehodet er plassert i riktig høyde fra overflaten. Hvis overflaten ikke er flat, vil arbeids avstanden endres under utskriftsprosessen. Hvis arbeids avstanden er mindre enn 0,1 mm, kan CaCl2 -løsnin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en AOARD stipend (nr. FA2386-18-1-4059), Nederland organisasjon for Scientific Research (NWO/OCW) som en del av grenser nanovitenskap programmet, og de avanserte materialer NWO-NSFC program (nr. 729.001.016). Forfatterne anerkjenner laboratorie hjelp av Ramon Van der Valk og Roland Kieffer.
Materials
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
