Tredimensionell Patterning av Engineered bio filmer med en gör-det-själv Bioprinter
Summary
Den här artikeln beskriver en metod för att omvandla en billig kommersiell 3D-skrivare till en bakteriell 3D-skrivare som kan under lätta utskrift av mönstrade bio filmer. Alla nödvändiga aspekter av beredningen av bioprinter och bio-Ink beskrivs, liksom verifieringsmetoder för att bedöma bildandet av bio filmer.
Abstract
Bio filmer är aggregat av bakterier inbäddade i en egenproducerad rumsligt mönstrad extracellulär matris. Bakterier inom en biofilm utvecklar förstärkt antibiotika resistens, som utgör potentiella hälso faror, men kan också vara fördelaktigt för miljö tillämpningar såsom rening av dricks vatten. Den fortsatta utvecklingen av anti-bakteriell terapi och biofilm-inspirerade tillämpningar kommer att kräva utveckling av reproducerbara, engineerable metoder för biofilm skapande. Nyligen har en ny metod för biofilm beredning med hjälp av en modifierad tredimensionell (3D) skrivare med en bakteriell bläck har utvecklats. Denna artikel beskriver de steg som krävs för att bygga denna effektiva, billig 3D-bioprinter som erbjuder flera applikationer i bakteriellt inducerad material bearbetning. Protokollet inleds med en anpassad kommersiell 3D-skrivare där extrudern har ersatts med en bio-bläck dispenser ansluten till en spruta pump system som möjliggör en kontrollerbar, kontinuerligt flöde av bio-bläck. För att utveckla en bio-Ink lämplig för biofilm utskrift, konstruerade Escherichia coli bakterier avbröts i en lösning av alginat, så att de stelnar i kontakt med en yta som innehåller kalcium. Införandet av en inducerare kemikalie inom det tryck substrat driver uttryck för biofilm proteiner inom tryckt bio-Ink. Denna metod möjliggör 3D-utskrifter av olika rumsliga mönster som består av diskreta lager av tryckta bio filmer. Sådana rumsligt kontrollerad bio filmer kan fungera som modell system och kan hitta applikationer inom flera områden som har en omfattande inverkan på samhället, inklusive antibiotika resistens förebyggande eller dricks vatten rening, bland annat.
Introduction
Det finns för närvarande ett ökande behov av att utveckla miljö vänliga, hållbara lösningar för produktion av rumsligt mönstrade material, på grund av det växande antalet marknader för sådant material1. Denna artikel presenterar en enkel, ekonomisk metod för produktion av sådana material och erbjuder därför ett stort spektrum av framtida tillämpningar. Den metod som presenteras här tillåter tredimensionell (3D) tryckning av rumsligt mönstrade strukturer med hjälp av en bio-bläck som innehåller levande bakterier. Bakterier förblir livskraftiga inom de tryckta strukturerna i över en vecka, vilket gör det möjligt för bakterierna att utföra naturliga eller konstruerade metaboliska aktiviteter. Tryckta bakterier kan därmed producera och sätta in önskade komponenter inom den tryckta strukturen, till exempel skapa en funktionell tvär bunden biofilm2.
Traditionella metoder för produktion av avancerade material innebär höga energi kostnader (t. ex. höga temperaturer och/eller tryck) och kan producera stora mängder kemiskt avfall, ofta giftiga ämnen som kräver kostnads omfattande användning3 ,4. Däremot kan flera bakterie arter producera material som är lätt att kunna tillämpas i olika branscher. Dessa material inkluderar polymerer såsom polyhydroxialkanoater (PHA)5 eller poly (glykolid-co-lactide) (pgla)6, bakteriell cellulosa7, bakterie betong material8, biomimetiska kompositer9, amyloid-baserade lim10, eller biobaserade elektriska brytare11, bland annat. Dessutom, bakterie produktion av värdefulla material sker typiskt vid nära omgivnings temperaturer och tryck och i vatten miljöer, utan att kräva eller producera giftiga föreningar. Medan producera material med bakterier har visats i litteraturen och vissa industriella tillämpningar har redan dykt upp12,13, en pålitlig metod för rumsliga mönstningar av sådana material är fortfarande en utmaning.
Denna artikel visar en rättfram metod för att omvandla en billig kommersiell 3D-skrivare i en 3D-bakteriell skrivare. Protokollet visar hur man förbereder en bio-bläck som innehåller och upprätthålla levande bakterier, samt hur man förbereder substrat på vilka 3D-utskrift kan utföras. Denna metod är lämplig att använda med en mängd olika naturliga och konstruerade bakterie stammar kunna producera material. Dessa bakterier kan vara rumsligt fördelade inom en 3D-tryckt struktur och fortfarande fortsätta sin metaboliska aktivitet, vilket kommer att resultera i en rumslig fördelning av de önskade materialen som produceras av bakterierna.
Denna tryck metod möjliggör additiv tillverkning av bio filmer, aggregat av bakterier omgivna av en egenproducerad extracellulär matris. Bio filmer är heterogena 3D-nätverk där proteiner, polymerer, bakterie celler, syre och näringsämnen är alla rumsligt strukturerade14. Även i form av en bio film, bakterier uppvisar en ökad antibiotika resistens och strukturell robusthet, vilket gör dem svåra att utrota från ytor inklusive medicinska katetrar och implantat. Nyckeln till biofilm egenskaper, och även den största utmaningen för biofilm forskning, verkar vara heterogenitet av bio filmer15,16,17. Produktion av rumsligt kontrollerad modell bio filmer är av särskilt intresse eftersom det skulle göra det möjligt att antingen reproducera eller trimma den rumsliga mönster av biofilm komponenter, medhjälp förståelsen av den stabila deposition av bio filmer på praktiskt taget alla ytor i Natur.
Denna artikel presenterar en metod för produktion av bio filmer med hjälp av 3D-tryckta vävnadsinväxt som innehåller konstruerade E. coli -bakterier som producerar biofilm proteiner i närvaro av en inducerare, samt metoder för verifiering av biofilm formation2 . De stora extracellulära matrix komponenterna i dessa bio filmer är curli amyloid fibrer18 som innehåller Självmonterade csga proteiner. När konstruerade E. coli bakterier induceras för att uttrycka csga proteiner, bildar de en stabil modell biofilm som skyddar cellerna mot att tvättas bort av tryck ytan. En sådan 3D tryckt biofilm kan rumsligt kontrol leras och kan fungera som ett användbart forsknings verktyg för utredning av multiskala biofilm struktur-funktion mekanik eller materiomik19. Dessa skräddarsydda bio filmer kommer att under lätta förståelsen av principerna för Biofilm bildning och deras mekaniska egenskaper, vilket möjliggör ytterligare forskning om mekanismerna för antibiotika resistens bland andra tillämpningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som presenteras här för 3D-utskrifter av konstruerade bio filmer har två kritiska steg. Först är förberedelserna av agartryckytan, som är den mest kritiska faktorn för att producera en specifik utskrifts upplösning. Det är viktigt att se till att tryck ytan är platt och att pipettspetsen på Skriv huvudet är placerad på rätt höjd från ytan. Om ytan inte är platt kommer arbets sträckan att ändras under utskrifts processen. Om arbets avståndet är mindre än 0,1 mm kan CaCl2 -l?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett AOARD-bidrag (nr. FA2386-18-1-4059), den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO/OCW) som en del av Frontiers of Nanoscience program, och avancerade material NWO-NSFC program (nr 729.001.016). Författarna erkänner laboratorie hjälp av Ramon van der Valk och Roland Kieffer.
Materials
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
