Искусственные РНК-полимераза II Удлинение Комплексы для вскрытия co-транскрипционной РНК обработки событий
Summary
Здесь мы описываем сборку РНК-полимеразы II (Pol II) удлиненных комплексов, требующих только коротких синтетических ДНК и Олигонуклеотидов РНК и очищенных Пол II. Эти комплексы полезны для изучения механизмов, лежащих в основе совместной транскрипционной обработки стенограмм, связанных с комплексом удлинения Пол II.
Abstract
Эукариотический синтез мРНК представляет собой сложный биохимический процесс, требующий транскрипции шаблона ДНК в прекурсор РНК многосубединым ферментом РНК-полимераза II и сотранскрипционным укупоркой и сплайсингом РНК-прекурсора для формирования зрелой мРНК. Во время синтеза мРНК комплекс удлинения РНК-полимеразы II является мишенью для регулирования большой коллекцией транскрипционных факторов, контролирующих его каталитической активностью, а также укупорки, сращивания и 3’обработки ферментов, которые создают зрелые мРНК. Из-за присущей им сложности синтеза мРНК более простые экспериментальные системы, позволяющие проводить изоляцию и исследование различных стадий сотранскрипции, обладают большой полезностью.
В этой статье мы описываем одну из таких простых экспериментальных систем, пригодных для исследования котранскрипционной РНК-укупорки. Эта система опирается на определенные комплексы рнк-полимеразы II, собранные из очищенной полимеразы и искусственных транскрипционных пузырьков. При обездвижении с помощью биотинителированной ДНК эти комплексы рнк-полимераза II удлинения обеспечивают легко манипулируемый инструмент для вскрытия котранскрипционной РНК-укупорки и механизмов, с помощью которых комплекс удлинения набирает и регулирует укудчивую фермент во время скотрансктионная РНК укупорки. Мы ожидаем, что эта система может быть адаптирована для изучения набора и/или сборки белков или белковых комплексов с ролями на других стадиях созревания мРНК в сочетании с комплексом вытяжения РНК-полимеразы II.
Introduction
Эукариотический посыльный РНК (мРНК) синтез является сложным биохимическим процессом, который включает в себя синтез необработанной РНК-прекурсоров РНК-полимераза II и обработка РНК-прекурсора для получения зрелой мРНК. Этапы обработки РНК, укупорки, сращивания и полиаденилаации выполняются в основном совместно транскрипционно. Комплекс удлинения Pol II служит эшафотом, который вербует и организует деятельность многих ферментов обработки РНК. Следовательно, наше окончательное понимание того, как образуются зрелые эукариотические мРНК, будет в значительной степени опираться на разработку экспериментальных систем, позволяющих рассеивать биохимические механизмы, лежащие в основе набора в удлинение комплекса и регулирование ферментов, ответственных за совместное транскрипционное укупорки, сплайсинг и полиаденилацию.
Неудивительно, что разработка таких экспериментальных систем была сложной задачей. Основным препятствием была замечательная сложность самой транскрипции Pol II, где просто ездовестяя базальную транскрипцию Pol II in vitro требует минимального набора из пяти общих факторов инициации транскрипции: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF и TFIIH 1. Кроме того, восстановление любого вида регулируемой транскрипции Pol II in vitro требует еще большего набора транскрипционных факторов и корегуляторов. Таким образом, основной целью было разработать более простые экспериментальные системы, позволяющие воссоздать активные комплексы удлинения Pol II, пригодные для исследования функционального соединения транскрипции Пол II и обработки РНК.
Один из таких простых методов для восстановления активных комплексов удлинения Пол II оказался полезным для структурных и биохимических исследований удлинения Pol II и, в последнее время, для исследования совместной транскрипционной обработки РНК2,3 ,4,5. В этой статье мы покажем, как комплексы удлинения Pol II, приготовленные из очищенного Поля II и синтетических пузырей транскрипции, могут быть эффективно использованы для исследования механизмов, лежащих в основе котранскрипционного укупорки зарождающихся транскриптов Pol II.
Capping относится к ковалентное добавление 5′-гуанозин “шапка” на 5′-трифосфат конце зарождающейся Пол II стенограммы. Крышка важна для последующих этапов созревания мРНК, транспортировки, перевода и других процессов6,7. Крышка добавляется совместно транскрипционно в пол II стенограммы фермента называют укупорки фермента. В клетках млекопитающих активные участки, ответственные за РНК 5′-трифосфатаза и гуанилил трансферазы деятельности фермента укупорки, содержатся в одном полипептиде8. Фермент укупорки завербован к комплексу удлинения Pol II через взаимодействия с еще не определенными поверхностями на теле Pol II и домене rpb1 carboxy-терминального (CTD) фосфорилона на Ser5 его гептапептида повторяет5. В комплексе удлинения фермент укупорки катализает добавление крышки 5′-гуанозин, как только зарождающийся транскрипт достигает длины не менее 18 нуклеотидов и вышел из канала выхода из полимеразной РНК. На первом этапе реакции укупорки, трифосфатазы гидролизов РНК 5′-трифосфат аудионизирует 5′-дифосфат. На втором этапе GTP гидролизуется до GMP гуанилил-трансферазой, образуя промежуточный фермент GMP-capping. Наконец, гуанылил трансферазы передает GMP в 5′-дифосфатный конец зарождающегося транскрипта для получения крышки.
Примечательной особенностью укупорки реакции является то, что совместнотранскрипционные укупорки (т.е. укупорки стенограмм, связанных с функциональными комплексами удлинения Пол II) является гораздо более эффективным, чем укупорки свободной РНК5,9. Таким образом, главный вопрос в этой области заключается в том, как эта драматическая активация укупорки достигается через взаимодействие фермента укупорки с комплексом удлинения Pol II. В этом протоколе мы описываем сборку активных комплексов рнк-полимеразы II с использованием только очищенной РНК-полимеразы II и искусственных транскрипционных пузырей. Эти методы позволяют создавать удлинение РНК-полимераза II комплексов с транскриптами определенной длины и последовательности. В недавнем исследовании, мы использовали эти определенные РНК полимеразы II удлинение комплексов в качестве модели для изучения аспектов механизмов РНК укупорки5. В частности, мы показали, что (i) укупорки РНК, связанные с этими удлинением комплексов, были более чем в 100 раз более эффективными, чем ограничение свободной РНК и (ii) стимулировалось TFIIH-зависимым фосфорилированием Pol II CTD. Описанный здесь подход в принципе можно было бы адаптировать для генерации субстратов для изучения других реакций по обработке РНК, связанных с комплексом удлинения Пол II.
В разделе 1 этого протокола, искусственные комплексы удлинения создаются путем аннулирования синтетического шаблона нити ДНК олигонуклеотида к Олигонуклеотид РНК, который дополняет в своем 3′-end примерно 9 нуклеотидов шаблона нити ДНК. Пол II затем загружается на ДНК: РНК дуплекс. Удлинение комплекс затем завершается добавлением частично дополняющих, не-шаблон наяп ДНК олигонуклеотида, который помечен с биотином на его 3′-конец (Рисунок 1 и Рисунок 2A). Олигонуклеотид РНК продлевается Полом II в этих удлиненных комплексах, чтобы сделать радиомаркированные транскрипты определенной длины и последовательности при добавлении соответствующих комбинаций радиомаркированных нуклеотидов. Кроме того, используя комбинацию смок для удаления неинкорпорированных нуклеотидов и дальнейшего добавления различных комбинаций нуклеотидов, можно «ходить» пол II в разные позиции по шаблону ДНК и синтезировать РНК определенных длин. РНК затем очищается и подвергается электрофорезу в денатурируя гели мочевины-PAGE. В разделе 2 протокола для анализа котранскрипционной РНК-укупорки используются комплексы искусственного удлинения. В приведенном примере представлены меры воздействия фосфорилирования TFIIH на совместное транскрипционное укупорки РНК. В этом эксперименте мы измеряем степень котранскрипционного укупорки как функцию укупорки концентрации фермента (5, 15 и 45 нг на реакцию) и время (1, 2 и 4 мин).
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследования, которые стремятся вскрыть события в сочетании с комплексом удлинения Pol II, таким как обработка РНК и регулирование самой удлинения стенограммы, могут быть значительно облегчены с помощью высокоочищенной ферментной системы. Настройка таких ферментных систем может быть с?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим С. Шумана за предоставление фермента укупорки млекопитающих кДНК. Эта работа была частично поддержана грантом Института медицинских исследований Stowers от Фонда медицинских исследований Хелен Нельсон в Большом Канзас-Сити. Исходные данные, лежащие в основе этой рукописи, можно получить из хранилища исходных данных Stowers в http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
