Arn artificiel Polymerase II Elongation Complexes pour disséquer les événements de traitement de l'ARN cotranscriptionnel
Summary
Ici, nous décrivons l’assemblage des complexes d’allongement de polymérase II d’ARN II (Pol II) exigeant seulement l’ADN synthétique court et les oligonucléotides synthétiques et pol II purifié. Ces complexes sont utiles pour étudier les mécanismes sous-jacents au traitement co-transcriptionnel des transcriptions associées au complexe d’allongement de Pol II.
Abstract
La synthèse eucaryote d’ARNm est un processus biochimique complexe exigeant la transcription d’un modèle d’ADN dans un ARN précurseur par la polymérase D’ARN II d’enzyme multi-subunit et le plafonnement et l’épissage co-transcriptionnels de l’ARN précurseur pour former l’ARNm mûr. Pendant la synthèse de l’ARNm, le complexe d’allongement de la polymérase DE l’ARN II est une cible de régulation par une vaste collection de facteurs de transcription qui contrôlent son activité catalytique, ainsi que les enzymes de plafonnement, d’épissage et de traitement de 3′ qui créent l’ARNm mature. En raison de la complexité inhérente de la synthèse de l’ARNm, des systèmes expérimentaux plus simples permettant l’isolement et l’étude de ses différentes étapes de cotranscription ont une grande utilité.
Dans cet article, nous décrivons un tel système expérimental simple approprié pour étudier le plafonnement co-transcriptionnel d’ARN. Ce système repose sur des complexes d’allongement de la polymérase II à ARN défini assemblés à partir de polymérase purifiée et de bulles de transcription artificielles. Lorsqu’ils sont immobilisés par l’ADN biotinylated, ces complexes d’allongement de polymérase II d’ARN fournissent un outil facilement manipulable pour disséquer le plafonnement et les mécanismes co-transcriptionnels d’ARN par lesquels le complexe d’élongation recrute et régule l’enzyme de plafonnement pendant co-transcriptionnel RNA plafonnement. Nous prévoyons que ce système pourrait être adapté pour étudier le recrutement et/ou l’assemblage de protéines ou de complexes protéiques avec des rôles à d’autres étapes de maturation de l’ARNm couplés au complexe d’allongement de la polymérase DE l’ARN II.
Introduction
La synthèse de l’ARN de messager eucaryotique (ARNm) est un processus biochimique élaboré qui implique la synthèse d’un ARN précurseur non traité par la polymérase II d’ARN et le traitement de l’ARN précurseur pour produire l’ARNm mûr. Les étapes de traitement de l’ARN du plafonnement, de l’épissage et de la polyadenylation sont effectuées en grande partie de façon cotranscription. Le complexe d’allongement Pol II sert d’échafaudage qui recrute et orchestre les activités de nombreuses enzymes de traitement de l’ARN. Par conséquent, notre compréhension ultime de la façon dont les ARNm eucaryotes matures sont générées dépendra fortement du développement de systèmes expérimentaux pour permettre la dissection des mécanismes biochimiques sous-jacents au recrutement au complexe d’allongement et la régulation des enzymes responsables du plafonnement, de l’épissage et de la polyadenylation cotranscriptionnel.
Comme on pouvait s’y attendre, le développement de tels systèmes expérimentaux a été difficile. Un obstacle majeur a été la complexité remarquable de la transcription Pol II elle-même où la simple reconstitution de la transcription basale par Pol II in vitro nécessite un ensemble minimum de cinq facteurs d’initiation à la transcription générale: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, et TFIIH 1. En outre, la reconstitution de toute forme de transcription réglementée de Pol II in vitro nécessite un ensemble encore plus grand de facteurs de transcription et de corégulateurs. Ainsi, un objectif majeur a été de développer des systèmes expérimentaux plus simples permettant la reconstitution de complexes d’allongement actifs Pol II adaptés aux investigations du couplage fonctionnel de la transcription de Pol II et du traitement de l’ARN.
Une telle méthode plus simple pour reconstituer les complexes actifs d’allongement de Pol II s’est avérée utile pour des études structurales et biochimiques de pol II allongée et, plus récemment, pour étudier le traitement co-transcriptionnel d’ARN2,3 ,4,5. Dans cet article, nous montrons comment les complexes d’allongement Pol II préparés à partir de Pol II purifiéet et bulles de transcription synthétiques peuvent être utilisés efficacement pour étudier les mécanismes sous-jacents co-transcriptionnel plafonnement des transcriptions naissantes Pol II.
Le plafonnement fait référence à l’ajout covalent d’un « bouchon » de 5′-guanosine à l’extrémité de 5′-triphosphate des transcriptions naissantes de Pol II. Le plafond est important pour les étapes ultérieures de maturation de l’ARNm, le transport, la traduction et d’autres processus6,7. Le bouchon est ajouté co-transcriptionnellement aux transcriptions de Pol II par une enzyme appelée enzyme de plafonnement. Dans les cellules de mammifères, les sites actifs responsables de l’ARN 5′-triphosphatase et guanylyl transferase activités de l’enzyme de plafonnement sont contenus dans un polypeptide unique8. L’enzyme de plafonnement est recrutée au complexe d’allongement Pol II par des interactions avec des surfaces encore à définir sur le corps Pol II et le domaine de carboxy-terminal Rpb1 (CTD) phosphorylé sur Ser5 de son heptapeptide répète5. Dans le complexe d’allongement, l’enzyme de plafonnement catalyse l’ajout d’un bouchon de 5′-guanosine une fois que la transcription naissante atteint une longueur d’au moins 18 nucléotides et a émergé du canal de sortie de l’ARN polymérase. Dans la première étape de la réaction de plafonnement, la triphosphatase hydrolyse l’ARN 5′-triphosphate pour produire un 5′-diphosphate. Dans la deuxième étape, GTP est hydrolysé à GMP par le transfert de guanylyl, formant une enzyme GMP-capping intermédiaire. Enfin, le transfert de guanylyl transfère GMP à l’extrémité 5′-diphosphate de la transcription naissante pour produire le bouchon.
Une caractéristique remarquable de la réaction de plafonnement est que le plafonnement co-transcriptionnel (c.-à-d., plafonnement des transcriptions associées aux complexes fonctionnels d’allongement de Pol II) est beaucoup plus efficace que le plafonnement de l’ARN libre5,9. Ainsi, une question majeure dans le domaine a été de savoir comment cette activation spectaculaire du plafonnement est réalisée par des interactions de l’enzyme de plafonnement avec le complexe d’allongement Pol II. Dans ce protocole nous décrivons l’assemblage des complexes actifs d’allongement de polymérase d’ARN II utilisant seulement la polymérase II purifiée d’ARN et les bulles artificielles de transcription. Ces méthodes permettent la création de complexes d’allongement de la polymérase D’ARN II avec des transcriptions de longueur et de séquence définies. Dans une étude récente, nous avons utilisé ces complexes d’allongement de la polymérase II à ARN défini comme modèle pour étudier les aspects des mécanismes de l’ARN plafonnant5. En particulier, nous avons montré que (i) le plafonnement de l’ARN associé à ces complexes d’allongement était plus de 100 fois plus efficace que le plafonnement de l’ARN libre et (ii) a été stimulé par la phosphorylation TFIIH-dépendante du CTD Pol II. L’approche décrite ici pourrait en principe être adaptée pour générer des substrats pour étudier d’autres réactions de traitement de l’ARN co-transcriptionnel liées au complexe d’allongement de Pol II.
Dans la section 1 de ce protocole, les complexes artificiels d’allongement sont créés en annealing un oligonucléotide synthétique de brin de modèle à un oligonucléotide d’ARN qui est complémentaire à son 3′-extrémité à approximativement 9 nucléotides de l’ADN de brin de modèle. Pol II est ensuite chargé sur le duplex DNA:RNA. Le complexe d’allongement est ensuite complété par l’ajout d’un oligonucléotide d’ADN brin partiellement complémentaire et non-modèle qui est étiqueté avec de la biotine à son 3′-extrémité (figure1 et figure 2A). L’oligonucléotide d’ARN est étendu par Pol II dans ces complexes d’allongement pour faire des transcriptions radiolabeled de longueur et de séquence définies sur l’addition des combinaisons appropriées des nucléotides radiolabeled. En outre, en utilisant une combinaison de lavages pour enlever les nucléotides non incorporés et l’ajout de différentes combinaisons de nucléotides, on peut “marcher” Pol II à différentes positions le long du modèle d’ADN et synthétiser l’ARN de longueurs définies. L’ARN est ensuite purifié et soumis à l’électrophorèse dans la dénaturation des gels urée-PAGE. Dans la section 2 du protocole, des complexes artificiels d’allongement sont utilisés pour analyser le plafonnement de l’ARN cotranscriptionnel. L’exemple présenté mesure l’effet de la phosphorylation TFIIH-dépendante du CTD de Pol II sur le plafonnement co-transcriptionnel d’ARN. Dans cette expérience, nous mesurons l’étendue du plafonnement co-transcriptionnel en fonction du plafonnement de la concentration enzymatique (5, 15 et 45 ng par réaction) et du temps (1, 2 et 4 min).
Protocol
Representative Results
Discussion
Les études qui cherchent à disséquer les événements couplés au complexe d’allongement de Pol II tels que le traitement de l’ARN et la régulation de l’allongement de transcription lui-même peuvent être grandement facilitées par l’utilisation d’un système enzymatique fortement purifié. La mise en place de tels systèmes enzymatiques peut être difficile. La transcription dépendante du promoteur par Pol II nécessite au moins cinq facteurs de transcription généraux. La préparation et le stockage de ces facte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions S. Shuman d’avoir fourni l’adncadapage de l’enzyme de plafonnement des mammifères. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention au Stowers Institute for Medical Research du Helen Nelson Medical Research Fund de la Greater Kansas City Community Foundation. Les données originales sous-jacentes à ce manuscrit peuvent être consultées à partir du dépôt de données d’origine Stowers à http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
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