Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler
Summary
Burada, sadece kısa sentetik DNA ve RNA oligonükleotides ve arıtılmış pol II gerektiren RNA polimeraz II (pol II) uzama kompleklerinin montajını tarif ediyoruz. Bu kompleksleri, Pol II uzama kompleksi ile ilişkili transkriptlerin Co-transcriptional işleme temel mekanizmaları eğitim için yararlıdır.
Abstract
Ökaryotik mRNA sentezi, bir DNA şablonunun, Multi-subunit enzim RNA polimeraz II ve Co-transcriptional kapatma ve preürosi RNA ‘nın olgun mRNA ‘yı oluşturacak şekilde birleştirilmesini gerektiren karmaşık bir biyokimyasal süreçtir. MRNA sentezi sırasında, RNA polimeraz II uzama kompleksi, katalitik aktivitesini kontrol eden büyük bir transkripsiyon faktörleri koleksiyonu ve olgun mRNA ‘yı yaratan 3 ‘ işleme enzimleri ile düzenleme yapmak için bir hedeftir. MRNA sentezinin içsel karmaşıklığı nedeniyle, yalıtım ve çeşitli ortak transkripsiyon aşamalarında araştırma sağlayan basit deneysel sistemler büyük bir yarar vardır.
Bu yazıda, ortak transcriptional RNA kapatma soruşturması için uygun bir basit deneysel sistem açıklanmaktadır. Bu sistem, saflaştırılmış polimeraz ve yapay transkripsiyon kabarcıklarının montajında tanımlanan RNA polimeraz II uzama kompleksine dayanır. Biyotinlenmiş DNA ile immobilize zaman, bu RNA polimeraz II uzama kompleksleri bir kolayca manipülasyon ortak transcriptional RNA kapatma ve mekanizmalar tarafından uzama kompleksi acemi ve düzenler sırasında enzimi sırasında sabitleme bir araç sağlar RNA ‘nın ortak transkripsiyon. Bu sistemin, RNA polimeraz II uzama kompleksine bağlanmış olan mRNA olgunlaşma diğer aşamalarında roller ile protein veya protein kompleksler istihdam ve/veya montaj eğitim için adapte olabilir tahmin.
Introduction
Ökaryotik haberci RNA (mRNA) sentezini RNA polimeraz II ve olgun mRNA verim için ön RNA işleme tarafından işlenmemiş bir ön-RNA sentezini içeren ayrıntılı bir biyokimyasal süreçtir. Capping, splicing ve Poliadenilasyon RNA işleme adımları büyük ölçüde ortak transkripsiyonlama gerçekleştirilir. Pol II uzama kompleksi, RNA işleme enzimlerinin çoğunun faaliyetlerini yapan ve düzenleyen bir iskele olarak hizmet vermektedir. Sonuç olarak, Olgun ökaryotik mrb ‘ların nasıl üretilmesine ilişkin en son anlayışımız, işe temel alan biyokimyasal mekanizmaların uzama kompleksine atılmasına izin vermek için deneysel sistemlerin gelişmesine ağır bir şekilde dayanacak ve Co-transcriptional kapatma, birleştirme ve polyadenilasyon sorumlu enzimlerin düzenlenmesi.
Şaşırtıcı değil, bu tür deneysel sistemlerin geliştirilmesi zor olmuştur. Büyük bir engel sadece pol II in vitro tarafından bazal transkripsiyon reconstituting beş genel transkripsiyon başlatma faktörleri en az bir dizi gerektirir pol II transkripsiyon kendisi olağanüstü karmaşıklığı olmuştur: TGı, TFııD, TGı, TFııF ve TFııH 1. dahası, her türlü DÜZENLENMIŞ pol II transkripsiyon içinde vitro reconstituting transkripsiyon faktörleri ve coregulators daha büyük bir dizi gerektirir. Böylece, önemli bir amaç, Pol II transkripsiyon ve RNA işleme fonksiyonel bağlantı incelemeleri için uygun aktif pol II uzama kompleksler reanayasa sağlayan basit deneysel sistemler geliştirmek olmuştur.
Aktif pol II uzama kompleksler reconstituting için böyle basit bir yöntem, uzun pol II ve daha Geçenlerde, Co-transcriptional RNA işleme araştırmak için yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için yararlı olduğunu kanıtladı2,3 ,4,5. Bu yazıda, nasıl pol II uzama kompleksleri saflaştırılmış pol II ve sentetik transkripsiyon kabarcıkları hazırlanan gösterir nasıl etkili mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir Co-transcriptional, nazcent pol II transkripsiyonlarını üst altta yatan.
Capping, 5 ‘-guanosin “Cap” ‘ in 5 ‘-trifosfat sonuna kadar bulunan pol II transkriptlerinin kovalent ilavesi anlamına gelir. Cap, mRNA olgunlaşma, taşıma, çeviri ve diğer süreçler6,7sonraki adımlar için önemlidir. Kap, enzimin tıkanması olarak adlandırılan bir enzim tarafından pol II transkriptleri için ortak transcrip, eklenir. Mammalin hücrelerinde, kapatma enziminin RNA 5 ‘-trifosfataz ve Guanil transferaz faaliyetlerinden sorumlu aktif siteler tek bir polipeptid8içinde yer alır. Kapatma enzim pol II vücut ve Rpb1 karboky-terminal alanı (CTD) Ser5 heptapeptid tekrarlar üzerinde fosforylated yüzeyler üzerinde henüz tanımlanmalıdır ile etkileşimler ile yan II uzama kompleksi için işe5. Uzama kompleksinde, en az 18 nükleotib uzunluğuna ulaştığında ve polimeraz RNA çıkış kanalından ortaya çıkan bir kez, 5 ‘-guanozin kapağının ilavesi ile katlanma enzimi katalizler. Kapatma reaksiyonu ilk adımda, trifosfataz 5 ‘-difosfat verim RNA 5 ‘-trifosfat hidrolize. İkinci adımda, GTP, Guanil transferase tarafından GMP ‘ye hidrolize edilir ve bir GMP-capping enzim orta oluşturur. Son olarak, Guanil transferaz, GMP ‘yi 5 ‘-difosfat sonuna kadar aktarıyor ve kapağı üretecektir.
Kapatma reaksiyonunun dikkat çekici bir özelliği, Co-transcriptional (örn., fonksiyonel pol II uzama kompleksler ile ilişkili transkripsiyon), serbest RNA5,9‘ dan çok daha etkilidir. Böylece, alandaki önemli bir soru, Pol II uzama kompleksi ile kapatma enziminin etkileşimleri yoluyla nasıl bu dramatik etkinleştirme işlemi elde edilmiştir. Bu protokolde, sadece arıtılmış RNA polimeraz II ve yapay transkripsiyon kabarcıkları kullanılarak aktif RNA polimeraz II uzama kompleklerinin montajı açıklanmaktadır. Bu yöntemler, tanımlanan uzunluk ve sıralı transkriptler ile RNA polimeraz II uzama kompleksleri oluşturulması sağlar. Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, RNA kaplama5mekanizmalarının yönlerini araştırmak için bir model olarak bu tanımlanan RNA polimeraz II uzama kompleksini kullandık. Özellikle, biz (i) RNA bu uzama kompleksleri ile ilişkili üst 100-kat daha fazla ücretsiz RNA ve (ii), Pol II CTD TFIıH bağımlı fosforilasyon tarafından uyarılmış daha verimli olduğunu gösterdi. Burada açıklanan yaklaşım, Pol II uzama kompleksine bağlı diğer ortak transcriptional RNA işleme reaksiyonları okumak için substratlar oluşturmak için uyarlanabilir.
Bu protokolün Bölüm 1 ‘ de, yapay uzama kompleksleri, sentetik bir şablon Strand DNA oligonükleotid bir RNA oligonükleotid tavlama tarafından oluşturulan 3 ‘-End yaklaşık 9 nükleotid şablon Strand DNA. Pol II daha sonra DNA üzerine yüklenir: RNA dubleks. Uzama kompleksi daha sonra, 3 ‘ End (Şekil 1 ve Şekil 2a) ile biotin ile etiketlenmiş kısmen tamamlayıcı, şablon içermeyen, DNA oligonükleotit ilavesi ile tamamlanır. RNA oligonükleotit, radyoaktif nükleotidler uygun kombinasyonları ilavesi üzerine tanımlanan uzunluk ve dizi radyoaktif transkriptler yapmak için bu uzama kompleksler pol II tarafından uzatılır. Buna ek olarak, uncorporated nükleotidler ve nükleotid farklı kombinasyonları daha da ilavesi kaldırmak için yıkımların bir kombinasyonu kullanarak, bir “pol II DNA şablonu boyunca farklı pozisyonlara yürüyebilir ve tanımlanan uzunlukları RNA sentezlemek. RNA daha sonra arıtılır ve denatüre üre-sayfa jeller içinde Elektroforez maruz. Protokolün Bölüm 2 ‘ de, yapay uzama kompleksleri, eş transkripsiyon RNA ‘nı analiz etmek için kullanılır. Bu örnek, Pol II CTD ‘nin TFIıH bağımlıdır fosforilasyonu ile birlikte transcriptional RNA ‘nın tıkanması üzerindeki etkisini ölçer. Bu deneyde, enzim konsantrasyonunun (5, 15 ve 45 ng reaksiyon başına) ve zaman (1, 2 ve 4 dk) olarak bir fonksiyon olarak ortak transcriptional kapak kapsamını ölçüyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA işleme ve transkript uzaması düzenlemesi gibi pol II uzama kompleksine birleşen olayları incelemek isteyen çalışmalar, yüksek derecede arıtılmış bir enzim sisteminin kullanımı ile büyük ölçüde kolaylaştırılabilir. Bu tür enzim sistemlerini kurmak zor olabilir. Pol II tarafından organizöre bağımlı transkripsiyon en az beş genel transkripsiyon faktörü gerektirir. Bu faktörlerin hazırlanması ve stoklama ay sürebilir; Bu nedenle, bu süreçte oran sınırlayıcı adım genellikle sadec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz meme kapatma enzim cDNA sağlayan S. Shuman teşekkür ederiz. Bu çalışma, büyük Kansas City Community Foundation ‘da Helen Nelson Tıp Araştırma Fonu ‘ndan yapılan Stowers Tıp Araştırmaları Enstitüsü ‘ne hibe tarafından kısmen destekleniyordu. Bu yazıda temel alınan orijinal veriler http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 adresinde bulunan Stowers Original veri deposundan erişilebilir.
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
