RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA
Summary
כאן, אנו מתארים את ההרכבה של RNA פולימראז II (Pol II) מתחמי התארכות הדורשים רק די-אן-איי סינתטי ו-RNA olig, ומטוהרים פול II. מתחמי אלה שימושיים עבור מנגנוני לימוד בבסיס עיבוד שכונתיות של התעתיקים הקשורים למכלול התארכות פול השני.
Abstract
הסינתזה של eukaryotic הוא תהליך ביוכימיים מורכב המחייב תמלול של תבנית DNA לתוך RNA מקודמת על ידי אנזים רב subunit RNA פולימראז II ו-co-transcript השילוב של RNA הקודמן כדי ליצור את mRNA בוגרת. במהלך סינתזה mRNA, מתחם התארכות RNA פולימראז II הוא יעד לרגולציה על ידי אוסף גדול של גורמי שעתוק השולטים בפעילות הקטליטית שלה, כמו גם הסגירה, השילוב, ו 3 ‘-עיבוד אנזימים היוצרים את mRNA בוגרת. בגלל המורכבות הטבועה של סינתזה של mRNA, מערכות ניסוי פשוטות יותר המאפשרות בידוד וחקירה של שלבי ההמרה השונים שלה יש תועלת רבה.
במאמר זה, אנו מתארים אחד מערכת ניסיונית פשוטה כזו המתאימה לחקירת הסגירה שיתוף RNA. מערכת זו מסתמכת על הגדרת RNA פולימראז II מתחמי התארכות התאספו מ פולימראז מטוהרים ובועות תעתיק מלאכותי. כאשר מקיבוע באמצעות ה-DNA biotinylated, אלה מתחמי התארכות RNA פולימו II מספקים כלי manipulable בקלות לניתוח מנגנוני הסגירה של RNA ומנגנונים שבהם מורכבות התארכות המגוייסים ומווסת את האנזים הסגירה במהלך שיתוף עם הסגירה של RNA. אנו מצפים מערכת זו יכול להיות מותאם ללימוד גיוס ו/או הרכבה של חלבונים או מתחמי חלבונים עם תפקידים בשלבים אחרים של התבגרות mRNA בשילוב למכלול התארכות RNA פולימראז II.
Introduction
Eukaryotic RNA (mRNA) סינתזה היא תהליך ביוכימיים מורכבים המערבת סינתזה של רנ א מעובד מעובד על ידי RNA פולימראז II ועיבוד של RNA הקודמן להניב mRNA בוגרת. פעולות עיבוד ה-RNA של הסגירה, החבור והפוליאדלציה מתבצעות במידה רבה באופן משותף. מתחם התארכות פול השני משמש כפיגום שמגוייסים ומתזמונים את פעילותם של רבים מאנזימי העיבוד של RNA. כתוצאה מכך, ההבנה האולטימטיבית של הדרך בה מופקים מערכת mrnas בוגרת, תסתמך במידה רבה על פיתוח מערכות נסיוניות כדי לאפשר ניתוח של המנגנונים הביוכימיים המשמשים לגיוס למכלול התארכות ו התקנה של אנזימים האחראים לסגירה משותפת, שחבור ופוליאדלציה.
לא באופן מפתיע, פיתוח מערכות נסיוניות כאלה היה קשה. מכשול גדול כבר המורכבות המדהימה של שעתוק פול השני עצמו היכן פשוט מחדש את התמלול בסיס על ידי פול השני בפריפרייה דורש קבוצה מינימלית של חמישה גורמים כלליים ליזום שעתוק: TFIIB יברות, TFIIB, TFIIB, TFIIB, ו TFIIB 1. יתר על כן, מחדש כל סוג של שעתוק פול II מוסדר בתוך מבחנה דורש קבוצה גדולה עוד יותר של מרכיבי שעתוק ומתאמים. כך, המטרה העיקרית הייתה לפתח מערכות ניסיוני פשוט המאפשר החוקה של מתחמי התארכות פעיל פול השני מתאים לחקירות של הזיווג הפונקציונלי של שעתוק פול השני ו-RNA עיבוד.
אחת שיטה פשוטה כזאת לחידוש מתחמי התארכות החדש של פול השני הוכיחה שימושי עבור מחקרים מבניים וביוכימיים של להאריך Pol II ו, לאחרונה, עבור חקירת שיתוף RNA עיבוד2,3 ,4,5. במאמר זה, אנו מראים כיצד פול התארכות מתחמים הכין מטוהרים פול II ובועות תמלול סינתטי ניתן להשתמש ביעילות כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים שיתוף החוצה של התעתיקים המתהווה פול השני.
הסגירה מתייחסת התוספת הקוולנטי של 5 ‘-guanosine “כובע” כדי 5 ‘-triphosphate לסיים את התעתיקים פול השני המתהווה. הכובע חשוב עבור השלבים הבאים של mrna התבגרות, תחבורה, תרגום, ותהליכים אחרים6,7. הכובע מתווסף בשיתוף פעולה לתעתיקים של פול השני על ידי אנזים המכונה אנזים סגירה. בתאי היונקים, אתרים פעילים האחראים RNA 5 ‘-triphosphatase ו guanylyl טרנספראז פעילויות של אנזים הסגירה כלולים בתוך פוליפטידים אחד8. האנזים הסגירה מגויס למכלול התארכות פול השני באמצעות אינטראקציות עם זאת כדי להיות משטחים מוגדרים על הגוף Pol II והתחום Rpb1 xy-מסוף (CTD) זרחניות על Ser5 הפטניות שלה חוזר על5. במתחם התארכות, האנזים הסגירה מזרז תוספת של 5 ‘-guanosine כובע פעם התעתיק המתהווה מגיע לאורך של לפחות 18 נוקלאוטידים והגיח מערוץ היציאה של RNA פולימראז. בשלב הראשון של תגובת הסגירה, triphosphatase הידרו RNA 5 ‘-triפוספט כדי להניב 5 ‘-diphosphate. בשלב השני, gtp הוא ידרוליזה ל-GMP על ידי guanylyl transferase, ויוצרים ביניים אנזים הסגירה של gmp. לבסוף, guanylyl טרנספראז העברת GMP לקצה 5 ‘-diphosphate של התעתיק המתהווה לייצר את הכובע.
תכונה יוצאת דופן של תגובת הסגירה היא שיתוף הסגירה המשותף (כלומר, הסגירה של התעתיקים הקשורים עם מכלולי התארכות פול 2 של פונקציונלי) הוא הרבה יותר יעיל מאשר הסגירה של RNA חינם5,9. לפיכך, השאלה העיקרית בתחום הייתה כיצד הפעלה דרמטית זו של הסגירה מושגת באמצעות אינטראקציות של אנזים הסגירה עם קומפלקס התארכות פול השני. בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההרכבה של פעיל RNA פולימראז II מתחמי התארכות באמצעות מטוהרים רק RNA פולימראז II ובועות תעתיק מלאכותי. שיטות אלה לאפשר יצירה של RNA פולימראז II מתחמי התארכות עם תעתיקים של אורך ורצף מוגדר. במחקר שנערך לאחרונה, השתמשנו אלה מוגדרים RNA פולימראז II מתחמי התארכות כמודל לחקירת היבטים של מנגנוני הסגירה של RNA5. בפרט, הראנו כי (אני) הסגירה של RNA הקשורים עם מתחמי התארכות אלה היה יותר מ 100-קיפול יעיל יותר מאשר הסגירה של RNA חינם ו (ii) היה מגורה על ידי TFIIH תלוי זרחון של השני של הפול CTD. הגישה המתוארת כאן יכולה עקרונית להיות מותאם כדי ליצור מצעים עבור לימוד אחרים שיתוף ההמרה לעיבוד RNA תגובות הקשורות למכלול התארכות פול II.
בסעיף 1 של פרוטוקול זה, מכלולי התארכות מלאכותיים נוצרים על-ידי חישול תבנית סינתטי גדיל ה-DNA olig, הגאות ל-RNA olig, משלימה ב 3 ‘-end שלה כ 9 נוקלאוטידים של ה-DNA תבנית סטרנד. פול II נטען לאחר מכן על ה-DNA: רנ א דופלקס. מתחם התארכות מושלם לאחר מכן על-ידי תוספת של משלימה באופן חלקי, DNA שאינו תבנית של החיבור האלחוטי, אשר מתויג עם ביוטין ב 3 ‘-end (איור 1 ואיור 2a). ה-RNA olig, הגאות והשפל מורחב על ידי פול השני במערכות התארכות אלה כדי להפוך את התעתיקים המוגדרים של האורך והרצף בתוספת של שילובים הולמים של הנוקלאוטידים. בנוסף, שימוש בשילוב של שוטף כדי להסיר נוקלאוטידים משולבים ותוספת נוספת של צירופים שונים של נוקלאוטידים, אחד יכול “ללכת” פול II למיקומים שונים לאורך תבנית ה-DNA ולסנתז RNA של אורכי מוגדר. RNA הוא לאחר מכן מטוהר ונתון לאלקטרופורזה בדאתהיכה שתנן-דף ג ‘ לים. בסעיף 2 לפרוטוקול, מערכות התארכות מלאכותיות משמשות לניתוח הסגירה של RNA שכונתיות. הדוגמה המוצגת מודדת את ההשפעה של זרחון התלוי ב-TFIIH של ה-CTD של הפול השני בנוגע לסגירה משותפת של RNA. בניסוי זה, אנו מודדים את היקף הסגירה של שיתוף הפעולה כפונקציה של הגבלת ריכוז האנזים (5, 15 ו 45 ng לכל תגובה) וזמן (1, 2 ו 4 דקות).
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים שמבקשים לבתר את האירועים ביחד למכלול התארכות פול השני כגון עיבוד רנ א ורגולציה של ההתארכות עצמה ניתן להקל מאוד על ידי שימוש במערכת אנזימים מאוד מטוהרים. הגדרת מערכות אנזימים כאלה יכולה להיות מאתגרת. התעתיק התלוי של היזם על ידי פול השני דורש לפחות חמישה גורמי שעתוק כלליים. הכנת הגור?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לס’ שומאן על אספקת האנזים להגבלת היונקים. עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מענק למכון הסטורים למחקר רפואי מקרן הלן נלסון לחקר הרפואה בקרן הקהילה רבתי בקנזס סיטי. ניתן לגשת לנתונים המקוריים שבבסיס כתב יד זה ממאגר הנתונים המקורי של סטורס ב-http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
