Kunstmatige RNA polymerase II-rek complexen voor het ontleden van co-transcriptionele RNA-verwerkings gebeurtenissen
Summary
Hier beschrijven we de assemblage van RNA polymerase II (Pol II) rek complexen waarvoor alleen korte synthetische DNA en RNA oligonucleotiden en gezuiverde Pol II. Deze complexen zijn nuttig voor het bestuderen van mechanismen die onderliggende co-transcriptionele verwerking van transcripties in verband met het Pol II rek complex.
Abstract
Eukaryotische mRNA-synthese is een complex biochemisch proces dat transcriptie van een DNA-template vereist in een precursor RNA door de multi-subunit enzym RNA polymerase II en co-transcriptionele capping en splicing van de precursor RNA om de volwassen mRNA te vormen. Tijdens de mRNA-synthese is het RNA polymerase II rek complex een doelwit voor regulering door een grote verzameling van transcriptiefactoren die de katalytische werking beheersen, evenals de capping, splicing en 3 ‘-processing enzymen die de volwassen mRNA creëren. Vanwege de inherente complexiteit van mRNA synthese, eenvoudigere experimentele systemen waardoor isolatie en onderzoek van de verschillende co-transcriptionele stadia hebben grote nut.
In dit artikel beschrijven we een dergelijk eenvoudig experimenteel systeem dat geschikt is voor het onderzoeken van co-transcriptionele RNA-capping. Dit systeem is gebaseerd op gedefinieerde RNA polymerase II rek complexen geassembleerd van gezuiverde polymerase en kunstmatige transcriptie bubbels. Wanneer geïmmobiliseerd via biotinyleerd DNA, deze RNA polymerase II rek complexen bieden een gemakkelijk losse tool voor het ontleden van co-transcriptionele RNA capping en mechanismen waarmee de rek complex rekruteert en regelt capping enzym tijdens Co-transcriptionele RNA-capping. We verwachten dat dit systeem kan worden aangepast voor het bestuderen van werving en/of assemblage van eiwitten of eiwitcomplexen met rollen in andere stadia van mRNA-rijping gekoppeld aan het RNA polymerase II-rek complex.
Introduction
Eukaryotische boodschapper RNA (mRNA) synthese is een uitgebreid biochemisch proces waarbij synthese van een onverwerkte precursor RNA door RNA polymerase II en verwerking van de precursor RNA om de volwassen mRNA te leveren. De RNA-verwerkingsstappen van capping, splicing en polyadenylering worden grotendeels co-transcriptioneel uitgevoerd. Het Pol II rek complex fungeert als een steiger die de activiteiten van veel van de RNA-verwerkings enzymen aanwerkent en organiseert. Bijgevolg zal ons uiteindelijke begrip van hoe volwassen eukaryotische Mrna’s worden gegenereerd, sterk afhangen van de ontwikkeling van experimentele systemen om een dissectie van de biochemische mechanismen die onderliggende rekrutering voor het rek complex te maken en regulatie van enzymen die verantwoordelijk zijn voor co-transcriptionele capping, splicing en polyadenylering.
Het is niet verrassend dat de ontwikkeling van dergelijke experimentele systemen moeilijk is geweest. Een belangrijke belemmering is de opmerkelijke complexiteit van de Pol II-transcriptie zelf, waarbij het simpelweg reconstitueren van basale transcriptie door Pol II in vitro een minimumreeks van vijf algemene transcriptie initiatie factoren vereist: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF en TFIIH 1. Bovendien vereist het reconstitueren van elke vorm van gereguleerde Pol II-transcriptie in vitro een nog grotere reeks transcriptiefactoren en coregulatoren. Zo is een belangrijk doel geweest om eenvoudigere experimentele systemen te ontwikkelen die de reconstitutie van actieve Pol II-rek complexen mogelijk maken, geschikt voor onderzoek naar de functionele koppeling van Pol II-transcriptie en RNA-verwerking.
Een dergelijke eenvoudigere methode voor het reconstitueren van actieve Pol II-rek complexen is nuttig gebleken voor structurele en biochemische studies van het verlengen van Pol II en, meer recentelijk, voor het onderzoeken van co-transcriptionele RNA-verwerking2,3 ,4,5. In dit artikel laten we zien hoe Pol II rek complexen bereid uit gezuiverde Pol II en synthetische transcriptie bellen effectief kunnen worden gebruikt om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de co-transcriptionele capping van ontluikende Pol II transcripten.
Capping verwijst naar de covalente toevoeging van een 5 ‘-Guanosine “dop” aan de 5 ‘-trifosfaat einde van ontluikende Pol II transcripten. Het GLB is belangrijk voor de volgende stappen van mRNA rijping, transport, vertaling, en andere processen6,7. Het GLB wordt co-transcriptioneel toegevoegd aan Pol II transcripten door een enzym dat “capping enzyme” wordt genoemd. In zoogdiercellen zijn actieve sites die verantwoordelijk zijn voor de RNA 5 ‘-trifosfatase en guanylyl transferase-activiteiten van het capping enzym opgenomen in één polypeptide8. Het capping enzym wordt gerekruteerd naar het Pol II rek complex door middel van interacties met nog te definiëren oppervlakken op het Pol II lichaam en de Rpb1 Carboxy-terminale domein (CTD) fosforyleerd op Ser5 van zijn heptapeptide herhalingen5. In het rek complex, het capping enzym katalyseert toevoeging van een 5 ‘-Guanosine Cap zodra de ontluikende transcriptie bereikt een lengte van ten minste 18 nucleotiden en is voortgekomen uit de polymerase RNA uitgang kanaal. In de eerste stap van de capping reactie hydrolyseert de trifosfatase het RNA 5 ‘-trifosfaat om een 5 ‘-difosfaat te leveren. In de tweede stap wordt GTP gehydrolyseerd tot GMP door de guanylyl transferase, die een GMP-capping enzym intermediair vormt. Ten slotte brengt de guanylyl transferase GMP over naar het 5 ‘-difosfaat einde van de ontluikende transcriptie om het GLB te produceren.
Een opmerkelijk kenmerk van de capping reactie is dat co-transcriptionele capping (d.w.z. het afdekken van transcripten geassocieerd met functionele Pol II-rek complexen) veel efficiënter is dan het afdekken van vrij RNA5,5. Zo is een belangrijke vraag in het veld geweest hoe deze dramatische activering van capping wordt bereikt via interacties van het capping-enzym met het Pol II-rekcomplex. In dit protocol beschrijven we de assemblage van actieve RNA polymerase II rek complexen met alleen gezuiverde RNA polymerase II en kunstmatige transcriptie bubbels. Deze methoden maken het creëren van RNA polymerase II rek complexen met transcripten van gedefinieerde lengte en sequentie mogelijk. In een recente studie, gebruikten we deze gedefinieerde RNA polymerase II rek complexen als een model voor het onderzoeken van aspecten van de mechanismen van RNA capping5. In het bijzonder toonden we aan dat (i) het afdekken van RNA in verband met deze rek complexen meer dan 100-voudig efficiënter was dan het afdekken van vrij RNA en (II) werd gestimuleerd door TFIIH-afhankelijke fosforylering van de Pol II CTD. De hier beschreven aanpak kan in principe worden aangepast om substraten te genereren voor het bestuderen van andere co-transcriptionele RNA-verwerkings reacties die verband houden met het Pol II-rek complex.
In sectie 1 van dit protocol worden kunstmatige rek complexen gemaakt door het gloeien van een synthetisch sjabloononderdeel DNA oligonucleotide op een RNA-oligonucleotide dat complementair is aan 3 ‘-end tot ongeveer 9 nucleotiden van het template-strand-DNA. Pol II wordt vervolgens op het DNA: RNA duplex geladen. Het rekcomplex wordt vervolgens aangevuld door toevoeging van een gedeeltelijk aanvullend, niet-template-strand-DNA-oligonucleotide dat met biotine wordt aangeduid op 3 ‘-end (Figuur 1 en Figuur 2a). Het RNA-oligonucleotide wordt door Pol II in deze rek-complexen verlengd om van transcripten van gedefinieerde lengte en sequentie te maken bij toevoeging van geschikte combinaties van van-nucleotiden. Bovendien, met behulp van een combinatie van wassingen te verwijderen van de rechtsgebied nucleotiden en verdere toevoeging van verschillende combinaties van nucleotiden, men kan “lopen” Pol II naar verschillende posities langs de DNA-sjabloon en synthetiseren van RNA van gedefinieerde lengtes. RNA wordt vervolgens gezuiverd en onderworpen aan elektroforese in denaturerende ureum-pagina gels. In sectie 2 van het protocol worden kunstmatige rek complexen gebruikt om co-transcriptionele RNA-capping te analyseren. Het gepresenteerde voorbeeld meet het effect van de TFIIH-afhankelijke fosforylering van de Pol II CTD op co-transcriptionele RNA-capping. In dit experiment meten we de mate van co-transcriptionele capping als een functie van capping enzym concentratie (5, 15 en 45 ng per reactie) en tijd (1, 2 en 4 min).
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies die zijn gericht op het ontleden van gebeurtenissen gekoppeld aan het Pol II rekcomplex zoals RNA verwerking en regulatie van de transcriptie verlenging zelf kunnen sterk worden vergemakkelijkt door het gebruik van een zeer gezuiverd enzymsysteem. Het opzetten van dergelijke enzym systemen kan een uitdaging zijn. Door de organisator afhankelijke transcriptie van Pol II zijn ten minste vijf algemene transcriptiefactoren vereist. Voorbereiding en inventarisatie van deze factoren kan maanden duren; Vandaar dat de sn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken S. Shuman voor het leveren van het zoogdier capping enzym cDNA. Dit werk werd deels gesteund door een subsidie aan het Stowers Institute for Medical Research van het Helen Nelson Medical Research Fund bij de Greater Kansas City Community Foundation. Originele gegevens die aan dit manuscript zijn gelinkt, kunnen worden geraadpleegd vanuit de Stowers Original data repository op http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
