الاصطناعي RNA بولميراز الثاني استطالة المجمعات لتشريح شارك في النسخ RNA معالجة الأحداث
Summary
هنا، ونحن نصف الجمعية من بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني (بول الثاني) المجمعات استطالة تتطلب فقط الحمض النووي الاصطناعية قصيرة وoligonucleotides الحمض النووي الريبي وتنقية بول الثاني. وهذه المجمعات مفيدة لدراسة الآليات التي تقوم عليها المعالجة المشتركة للنسخ من النصوص المرتبطة بمجمع استطالة بولس الثاني.
Abstract
Eukaryotic mRNA التوليف هو عملية كيميائية حيوية معقدة تتطلب نسخ من قالب الحمض النووي الريبي في الحمض النووي الريبي السلائف من قبل متعددة subunit إنزيم RNA بولميراز الثاني وco-transcriptional السد والربط من الحمض النووي الريبي السلائف لتشكيل mRNA ناضجة. أثناء توليف mRNA، فإن مجمع استطالة الميرنا ً الثاني هو هدف للتنظيم من خلال مجموعة كبيرة من عوامل النسخ التي تتحكم في نشاطه الحفاز، فضلاً عن الأنزيمات المتوجة، والربط، و3′-المعالجة التي تخلق الميرنا الناضجة. وبسبب التعقيد المتأصل في توليف الحمض النووي الريبي، فإن النظم التجريبية الأبسط التي تمكن من العزلة والتحقيق في مختلف مراحلها النسخية المشتركة لها فائدة كبيرة.
في هذه المقالة، ونحن نصف واحد من هذا النظام التجريبي بسيطة مناسبة للتحقيق في تغطية RNA النسخ المشترك. يعتمد هذا النظام على مركبات استطالة RNA Polymerase II المحددة التي تم تجميعها من البلمرة النقية وفقاعات النسخ الاصطناعية. عندما شلت عن طريق الحمض النووي biotinylated، هذه المجمعات الانياطي الحمض النووي الريبي الثاني توفر أداة يمكن المناوية بسهولة لتشريح الحمض النووي الريبي النسخي المشترك السد والآليات التي المجندين مجمع استطالة وينظم الانزيم السد خلال [ك-كّوأيشنل] [رنا] يغطّي. ونحن نتوقع أن يتم تكييف هذا النظام لدراسة التوظيف و / أو تجميع البروتينات أو مجمعات البروتين مع أدوار في مراحل أخرى من نضج mRNA إلى جانب مجمع استطالة الحمض النووي الريبي الثاني.
Introduction
Eukaryotic رسول RNA (mRNA) التوليف هو عملية كيميائية حيوية معقدة التي تنطوي على توليف الحمض النووي الريبي السلائف غير المجهزة من قبل الحمض النووي الريبي البليمرالثاني وتجهيز الحمض النووي الريبي السلائف لإنتاج mRNA ناضجة. يتم تنفيذ خطوات معالجة RNA من السد، الربط، وpolyadenyly إلى حد كبير co-transcriptionally. يعمل مجمع استطالة Pol II كسقالة تقوم بتجنيد وتنسيق أنشطة العديد من إنزيمات معالجة الحمض النووي الريبي. وبالتالي، فإن فهمنا النهائي لكيفية توليد mRNAs eukaryotic ناضجة سوف تعتمد بشكل كبير على تطوير النظم التجريبية للسماح تشريح الآليات البيوكيميائية الكامنة وراء التوظيف في مجمع استطالة و تنظيم الإنزيمات المسؤولة عن الجمع بين النسخ، الربط، وpolyadenylation.
وليس من المستغرب أن يكون تطوير هذه النظم التجريبية صعبا. وكان أحد العوائق الرئيسية هو التعقيد الملحوظ للنسخ السياسي الثاني نفسه حيث يتطلب ببساطة إعادة تشكيل النسخ القاعدي من قبل بولس الثاني في المختبر مجموعة دنيا من خمسة عوامل بدء النسخ العامة: TFIIB، TFIID، TFIIE، TFIIF، وTFIIH 1– وعلاوة على ذلك، فإن إعادة تشكيل أي نوع من النسخ الخاضع للتنظيم في المختبر يتطلب مجموعة أكبر من عوامل النسخ والجهات التنظيمية المشتركة. وهكذا، كان أحد الأهداف الرئيسية هو تطوير نظم تجريبية أبسط تسمح بإعادة تشكيل مجمعات استطالة Pol II النشطة المناسبة للتحقيقات في الاقتران الوظيفي للنسخ ومعالجة الحمض النووي الريبي.
وقد ثبت أن إحدى هذه الطرق الأبسط لإعادة تشكيل مجمعات استطالة Pol II النشطة مفيدة للدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية للفترة التي تمد فيها Pol II، وفي الآونة الأخيرة، للتحقيق في معالجة الحمض النووي الريبي النسخي المشترك2و3 ،4،5. في هذه المقالة، نبين كيف يمكن استخدام مجمعات استطالة Pol II المعدة من الفقاعات المنقّدة من Pol II والنسخ الاصطناعية بشكل فعال للتحقيق في الآليات الكامنة وراء وضع حد أقصى للنسخ المشترك لنصوص بولس الثانية الوليدة.
يشير الحد الأقصى إلى إضافة “غطاء” 5′-guanosine إلى نهاية 5′-ثلاثي الفوسفات من النصوص الوليدة Pol II. الحد الأقصى مهم للخطوات اللاحقة من النضج mRNA، والنقل، والترجمة، وغيرها من العمليات6،7. يتم إضافة الغطاء بشكل مشترك إلى نسخ بول الثاني بواسطة إنزيم يشار إليه باسم إنزيم السد. في خلايا الثدييات ، يتم احتواء المواقع النشطة المسؤولة عن أنشطة RNA 5′-triphosphatase وguanylyl transferase من إنزيم السد داخل ببتيد واحد8. يتم تجنيد إنزيم السد إلى مجمع استطالة بول الثاني من خلال التفاعلات مع الأسطح التي لم يتم تعريفها بعد على الجسم بول الثاني والمجال Rpb1 كاربوكسي المحطة الطرفية (CTD) فوسفوريلاتيد على Ser5 من البعيبتيدات5. في مجمع استطالة، يحفز إنزيم السد إضافة غطاء 5′-guanosine بمجرد أن يصل النص الوليد إلى طول لا يقل عن 18 نيوكليوتيدات وخرج من قناة خروج الحمض النووي الريبي البوليمر. في الخطوة الأولى من رد الفعل السد، وtriphosphatase تحلل الحمض النووي الريبي 5′-ثلاثي الفوسفات لإنتاج 5′-ثنائي الفوسفات. في الخطوة الثانية، يتم تحلل GTP إلى GMP بواسطة transferase guanylyl، وتشكيل إنزيم GMP-السد المتوسطة. وأخيراً، ينقل guanylyl transferase GMP إلى نهاية 5′-ثنائي الفوسفات من النص الوليد لإنتاج الغطاء.
وهناك سمة ملحوظة من رد الفعل متوجا هو أن تغطية النسخ المشترك (أي، وضع حد أقصى للنصوص المرتبطة بمجمعات استطالة Pol II الوظيفية) هو أكثر كفاءة بكثير من الحد الأقصى من RNAالحرة 5،9. وهكذا، كان السؤال الرئيسي في هذا المجال كيف يتم تحقيق هذا التنشيط الدرامي للتغطية من خلال تفاعلات إنزيم السد مع مجمع استطالة Pol II. في هذا البروتوكول نصف التجمع من المجمعات الاتطالية RNA الثاني النشط باستخدام فقط تنقية RNA بولميراز الثاني وفقاعات النسخ الاصطناعي. تسمح هذه الطرق بإنشاء مجمعات استطالة RNA polymerase II مع نصوص ذات طول وتسلسل محددين. في دراسة حديثة، استخدمنا هذه المجمعات الميرليمرة الثانية تعريف الحمض النووي الريبي كنموذج للتحقيق في جوانب آليات RNA متوجا5. وعلى وجه الخصوص، أظهرنا أن ‘1’ الحد الأقصى لRNA المرتبط بهذه المجمعات الاستطالة كان أكثر من 100 أضعاف أكثر كفاءة من الحد الأقصى للRNA الحرة و ‘2’ تم تحفيزه من قبل الفسفور المعتمد على TFIIH من CTD Pol II. ويمكن من حيث المبدأ تكييف النهج الموصوف هنا لتوليد ركائز لدراسة ردود الفعل الأخرى لمعالجة الحمض النووي الريبي المشترك المرتبطة بمجمع استطالة Pol II.
في القسم 1 من هذا البروتوكول، يتم إنشاء مجمعات استطالة اصطناعية عن طريق صلب قالب اصطناعي حبلا الحمض النووي oligonucleotide إلى oligonucleotide RNA التي هي مكملة في 3′-نهاية إلى ما يقرب من 9 النيوكليوتيدات من الحمض النووي حبلا قالب. ثم يتم تحميل Pol II على الحمض النووي: RNA دوبلكس. ثم يتم الانتهاء من مجمع استطالة بإضافة تكميلية جزئيا، غير قالب حبلا الحمض النووي oligonucleotide التي وصفت مع البيوتين في 3′-نهاية (الشكل1 والشكل 2A). يتم توسيع oligonucleotide RNA من قبل بول الثاني في هذه المجمعات استطالة لجعل النصوص ذات العلامات الراديوية من طول محدد وتسلسل على إضافة تركيبات مناسبة من النيوكليوتيدات ذات العلامات الراديوية. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام مزيج من الإذاج لإزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة وإضافة أخرى من تركيبات مختلفة من النيوكليوتيدات، يمكن للمرء أن “يمشي” Pol II إلى مواقف مختلفة على طول قالب الحمض النووي وتوليف الحمض النووي الريبي من أطوال محددة. ثم يتم تنقية الحمض النووي الريبي وإخضاعه للكتروفوريس في المواد الهلامية اليوريا PAGE denaturing. في القسم 2 من البروتوكول، يتم استخدام مجمعات استطالة اصطناعية لتحليل تغطية الحمض النووي الريبي النسخي المشترك. وقدم المثال تدابير تأثير الفسفورية المعتمدة على TFIIH من CTD Pol II على الرنا النسخي المشترك السد. في هذه التجربة، نقوم بقياس مدى الكبة النسخية المشتركة كدالة لتركيز إنزيم السد (5 و15 و45 نانوغرام لكل رد فعل) والوقت (1 و2 و4 دقيقة).
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن تسهيل الدراسات التي تسعى إلى تشريح الأحداث إلى جانب مجمع استطالة Pol II مثل معالجة الحمض النووي الريبي وتنظيم استطالة النص نفسه إلى حد كبير باستخدام نظام إنزيم عالي النقاء. إنشاء مثل هذه النظم الإنزيم يمكن أن يكون تحديا. ويتطلب النسخ المعتمد على المروج من قبل الشرطة الثانية خمسة عوامل ع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر س. شومان على توفير الانزيم اتلاف الثدييات cDNA. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا بمنحة لمعهد أبراج للبحوث الطبية من صندوق هيلين نيلسون للبحوث الطبية في مؤسسة مجتمع مدينة كانساس الكبرى. يمكن الوصول إلى البيانات الأصلية التي تستند إليها هذه المخطوطة من مستودع البيانات الأصلية في Stowers في http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
