Summary
ここでは、短い合成DNAとRNAオリゴヌクレオチドと精製されたPol IIのみを必要とするRNAポリメラーゼII(Pol II)伸長複合体の組み立てについて説明する。これらの複合体は、Pol II伸長複合体に関連する転写物の共転写処理の基礎となるメカニズムを研究するのに有用である。
Abstract
真核生物mRNA合成は、成熟したmRNAを形成する前駆体RNAの多サブユニット酵素RNAポリメラーゼIIおよび共写物キャッピングおよびスプライシングにより前駆体RNAへのDNAテンプレートの転写を必要とする複雑な生化学的プロセスである。mRNA合成中、RNAポリメラーゼII伸長複合体は、その触媒活性を制御する転写因子の大規模なコレクション、ならびに成熟したmRNAを作成するキャッピング、スプライシング、および3'処理酵素による調節の標的である。mRNA合成の本質的な複雑さのために、その様々な共転写段階の単離および調査を可能にするより単純な実験システムは大きな有用性を持っている。
本稿では,同写物RNAキャッピングの研究に適したそのような単純な実験システムについて述べた.このシステムは、精製されたポリメラーゼおよび人工転写気から組み立てられた定義されたRNAポリメラーゼII伸長複合体に依存する。ビオチン化DNAを介して固定化すると、これらのRNAポリメラーゼII伸長複合体は、同転写RNAキャッピングと、伸び複合体がカッピング酵素を募集し、調節するメカニズムを解剖するための容易に可動化可能なツールを提供します。共写RNAキャッピング。このシステムは、RNAポリメラーゼII伸長複合体に結合されたmRNA成熟の他の段階における役割を有するタンパク質またはタンパク質複合体の募集および/または組み立てを研究するために適応できると期待される。
Introduction
真核生物メッセンジャーRNA(mRNA)合成は、RNAポリメラーゼIIによる未処理前駆体RNAの合成および成熟したmRNAを得るための前駆体RNAの処理を含む精巧な生化学的プロセスである。キャッピング、スプライシング、およびポリアデニル化のRNA処理ステップは、主に共写的に行われる。Pol II伸長複合体は、RNA処理酵素の多くの活動を募集し、調整する足場として機能します。その結果、成熟した真核生物mRNAがどのように生成されるかについての我々の究極の理解は、伸長複合体への募集の基礎となる生化学的メカニズムの解剖を可能にする実験システムの開発に大きく依存し、共転写キャッピング、スプライシング、およびポリアデニル化を担当する酵素の調節。
当然のことながら、このような実験システムの開発は困難であった。主な障害は、単にインビトロでPol IIによって基底転写を再構成するだけで、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、およびTFIIHの5つの一般的な転写開始因子の最小セットを必要とするPol II転写自体の顕著な複雑さでした。さらに、インビトロで規制されたPol II転写の任意の並べ替えを再構成するには、転写因子と共レギュレータのより大きなセットが必要です。したがって、主な目標は、Pol II転写およびRNA処理の機能結合の研究に適した活性Pol II伸長複合体の再構成を可能にする、より単純な実験システムを開発することである。
活性Pol II伸長複合体を再構成するためのそのようなより簡単な方法の1つは、細長いPol IIの構造および生化学的研究に有用であることが証明されており、さらに最近では、共転写RNA処理2、3を研究するために有用である。 、4、5.本稿では、精製されたPol IIと合成転写気泡から調製されたPol II伸長複合体を効果的に使用して、新生Pol II転写物の共転写キャッピングのメカニズムを調べることができる方法を示す。
キャッピングとは、5'-グアノシン「キャップ」を、生まれつきのPol II転写物の5'-三リン酸末端に共生添加することをいう。キャップは、mRNAの成熟、輸送、翻訳、およびその他のプロセス6、7の後続のステップで重要です。キャップは、キャッピング酵素と呼ばれる酵素によってPol II転写物に共写物を添加する。哺乳動物細胞において、キャッピング酵素のRNA 5'-三ホスファターゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ活性を担う活性部位は、単一のポリペプチド8内に含まれる。キャッピング酵素は、そのヘプタペプチドのSer5上でリン酸化されたPol II体およびRpb1カルボキシ末端ドメイン(CTD)上の未定義の表面との相互作用を通じてPol II伸長複合体に募集される5。伸長複合体では、キャッピング酵素は、生まれつき転写物が少なくとも18ヌクレオチドの長さに達し、ポリメラーゼRNA出口チャネルから出現した後、5'-グアノシンキャップの添加を触媒する。キャッピング反応の最初のステップでは、三ホスファターゼはRNA 5'-三リン酸を加水分解し、5'--二リン酸を得る。第2工程では、GTPをグアニチルトランスフェラーゼによってGMPに加水分解し、GMPキャッピング酵素中間体を形成する。最後に、グアニュリルトランスフェラーゼは、GMPを生まれつき転写物の5'-二リン酸末端に移し、キャップを産生する。
キャッピング反応の顕著な特徴は、同写物キャッピング(すなわち、機能的Pol II伸長複合体に関連する転写物のキャッピング)が遊びRNA5,9のキャッピングよりもはるかに効率的である。したがって、この分野の大きな問題は、キャッピングのこの劇的な活性化がPol II伸長複合体とのキャッピング酵素の相互作用によってどのように達成されるのかである。このプロトコルでは、精製されたRNAポリメラーゼIIおよび人工転写気泡のみを用いた活性RNAポリメラーゼII伸長複合体の組み立てについて説明する。これらの方法は、定義された長さと配列の転写物を有するRNAポリメラーゼII伸長複合体の作成を可能にする。最近の研究では、これらの定義されたRNAポリメラーゼII伸長複合体をRNAキャッピング5のメカニズムの側面を調査するためのモデルとして使用した。特に、これらの伸長複合体に関連するRNAのキャッピングは、遊値RNAのキャッピングよりも100倍以上効率的であり、(ii)はPol II CTDのTFIIH依存性リン酸化によって刺激されたことを示した。ここで説明するアプローチは、原則として、Pol II伸長複合体にリンクされた他の共転写RNA処理反応を研究するための基板を生成するように適合させることができる。
このプロトコルのセクション1では、人工伸び複合体は、合成テンプレート鎖DNAオリゴヌクレオチドを、テンプレート鎖DNAの約9ヌクレオチドに対してその3'末端で相補的であるRNAオリゴヌクレオチドにアニールすることによって作成される。次に、Pol II が DNA:RNA 二重鎖にロードされます。伸長複合体は、その3'末端でビオチンで標識された部分的に相補的な非テンプレート鎖DNAオリゴヌクレオチドを添加することによって完了する(図1および図2A)。RNAオリゴヌクレオチドは、これらの伸長複合体におけるPol IIによって拡張され、放射性標識ヌクレオチドの適切な組み合わせの添加時に定義された長さと配列の放射標識転写物を作る。さらに、未組み込みのヌクレオチドを除去するワッシュの組み合わせを使用して、ヌクレオチドの異なる組み合わせをさらに添加し、1つは、DNAテンプレートに沿って異なる位置にPol IIを「歩く」と定義された長さのRNAを合成することができます。RNAは次いで精製され、尿素-PAGEゲルを脱ナーチジンで電気泳動を受ける。プロトコルのセクション2では、人工伸長複合体が共転写RNAキャッピングを分析するために使用される。提示された例は、共転写RNAキャッピングに対するPol II CTDのTFIIH依存リン酸化の効果を測定する。本実験では、キャッピング酵素濃度(反応当たり5、15、45ng)と時間(1、2、4分)の関数として、共写物キャッピングの程度を測定した。
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Protocol
1. 人工伸びコンプレックスの組み立てとポルIIウォーキング
- 磁気ビーズ上の3'ビオチン分子を含む非テンプレートDNAオリゴの1 nmolを固定化する。
注:次の手順は、将来の実験に備えるために事前に行うことができます。このプロトコルで使用されるすべてのオリゴ配列は表1に示されています。RNAオリゴは、5'-三リン酸修飾で合成される。- 低タンパク質結合1.5 mLチューブに200 μLの磁気ビーズ(10mg/mL)を加え、磁気ラックに2分間置きます。
- チューブが磁気ラック上にある間は、ビーズを邪魔することなくチューブから液体を取り出します。ビーズを洗浄するには、ラックからチューブを取り外し、5 mM Tris-HCl pH 7.5、0.5 mM EDTA、1 M NaCl を追加し、チューブをラックに戻し、2 分後に洗浄液を取り外します。
- 同じバッファーの200 μLを使用して、さらに2回洗い返します。
- 10 mMトリス-HCl pH 7.5、1 mM EDTA、2 M NaCl、バッファーの 400 μL で磁気ビーズを再中断します。次に、H2 Oの380 μLと10 μMの非テンプレートバイオチニル化DNAオリゴの20 μLと混合します。チューブをヌタターの上に置き、室温で30分間インキュベートします。
- 5 mMトリス-HCl pH 7.5の200 μLで固定化された非テンプレートDNAオリゴを3回洗浄し、 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, その後、20 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 20% グリセロール, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.5 mg/mL ウシ血清アルブミンの200 μLで3倍.
- チューブを4°Cで一晩放置し、BSAでビーズを遮断します。
- 翌日、チューブを磁気ラックに入れ、液体を取り出して廃棄し、20mM HEPES-NaOH pH 7.9、20%グリセロール、100mM KCl、1mM EDTA、0.5mg/mLウシ血清アルブミンを新しいチューブに移し、ビーズを200μLで再懸濁させます。このDNAテンプレートの場合、最終濃度は約5μMです。
注:インキュベーション時間とオリゴ濃度は、ビオチン化DNAオリゴごとに経験的に決定する必要があります。このテンプレートは、200の反応のために十分に提供する必要があり、4 °Cで保存した場合、少なくとも6ヶ月間続きます。
- アニールRNAおよびDNAテンプレート鎖オリゴヌクレオチドオリゴは、2:1モル比(それぞれ20および10pmol)でDNA:RNA二重鎖を得た。
- 表 2に説明するように、10 μL のアニーリング ミックスを設定します。
注:10 μLのアニーリングミックスは10の反応で十分です。より多くのアッセイを実行する場合は、アニーリングミックスを必要に応じてスケールアップすることができます。 - 次のプログラムを使用して熱サイクラーでアニール反応を実行します:45°Cで5分、その後、それぞれ2分の12サイクル、43°Cから始まり、サイクルあたりの温度2 °Cを減少させます。4 °Cでアイドル。
注:これは柔軟なタイムポイントです。アニーリングは約30分以内に終了しますが、より長い期間4°Cに残すことができます。実験室では、アニーリング混合物は、反応効率の低下を観察することなく、最大4時間座って残されています。 - RNAをテンプレート鎖DNAにアニーリングしながら、プロトコルの後のステップ用のバッファーを準備する。各バッファーを 1 つの反応に対して各バッファーを準備するために必要な成分を表 2 ~ 8に示します。[Y(X+1) + 1] の係数でレシピをスケールアップし、その他のすべてのバッファーの [X+1] と [X+1] を使用します。X = 調製する反応の数;Y = 必要な洗浄ステップ数(最小3)。
注:実験の日に新鮮なすべてのバッファを準備します。PVAをバッファに追加した後は、チューブを氷の上に置かないようにしてください。使用する直前にバッファーにPol IIまたはヌクレオチドを追加します。
- 表 2に説明するように、10 μL のアニーリング ミックスを設定します。
- 精製されたRNAポリメラーゼIIをDNA:RNAハイブリッドにロードします。
- DNAの1pmol(1 μL)を混合:13 μLのPol IIバッファーを持つRNAデュプレックス(表3より)。
- 精製されたRNA Pol II(1μL)をステップ1.3.1から混合物に約0.02単位加え、気泡を導入することなく、ピペット先端でゆっくりと上下にピペットでかき混ぜて混ぜます。30°Cで10分間インキュベートします。
注:ここから与えられるボリュームは、単一の反応のためです。実験の反応の数に必要に応じてスケールアップします。記載の10としてラット肝臓から精製されたRNA Pol IIは、この例で使用される。しかしながら、培養哺乳動物細胞または酵母を含む他の供給源から精製されたRNA PolIIは、3、4、5、11、12、13も用いることができる。
- ビオチン化非テンプレートDNAを添加して伸長複合体を完成させる。
- 固定化された非テンプレートDNAオリゴの5pmol(1 μL)を非テンプレートDNAバッファーの14 μLに加え(表4より)、ステップ1.3.2からチューブに加え、37°Cで10分間インキュベートする。
- サンプルを磁気ラックに2分間磁気ラックに入れ、30μLの洗浄バッファー(表7から)で1xを洗浄し、未組み込みのPol IIとオリゴを除去します。
- 放射標識RNA 23mersを含む伸び錯複合体を生成する。
- 30°Cでさらなるインキュベーションをすべて行います。パルスバッファーの 23 μL に [α-32P] UTP (3,000 Ci/mmol) の 15 μL ATP および 10 μCi (1 μL) を 1 μL を追加し、これを使用して洗浄された磁気ビーズを再サスペンドします。
注意:放射性物質は危険です。適切な保護具を着用し、放射性物質の安全な使用と処分のためのすべてのラボガイドラインに従ってください。
注:ウェスタンブロット実験など、放射標識されたRNAが不要な場合は、放射標識されたUTPを15 μM UTPに置き換えます。 - 10分間反応をインキュベートし、放射標識された23mersの合成を可能にする。
- 100 μM ATP と 100 μM UTP ミックスを含む溶液を 3.5 μL のチェイス バッファーに追加し、組み立て済みの伸びコンプレックスを含むチューブに追加し、5 分間インキュベートしてすべての生まれつき転写物を 23mers に追いかけます。
- サンプルを磁気ラックに2分間入れ、上清を取り除き、30μLの洗浄バッファーで1回洗浄し、未組み込みのヌクレオチドを除去し、30μLの洗浄バッファーで再中断します。
- 94 μLのストップミックスをプロテネーゼKおよびグリコーゲン(表9)で加えて反応を終了するか、セクション1.6に進み、より長い転写物またはセクション2を持つ伸長複合体を生成してキャッピングアッセイを行います。
- 30°Cでさらなるインキュベーションをすべて行います。パルスバッファーの 23 μL に [α-32P] UTP (3,000 Ci/mmol) の 15 μL ATP および 10 μCi (1 μL) を 1 μL を追加し、これを使用して洗浄された磁気ビーズを再サスペンドします。
- (オプション)23、25、および29ヌクレオチド転写物を作るためにポールIIを歩く
- 手順 1.2.1 ~ 1.5.4 で説明する手順に従って、放射標識付き 23mers を含む伸び複合体を準備します。4倍にスケールアップして、120μLの洗浄伸長複合体を生成します。
- ラベル 3 新しいチューブ "23mer", "25mer"と "29mer".洗浄された伸長複合体の30 μLを「23mer」チューブに移し、プロテネーゼKおよびグリコーゲンとのストップミックスの94 μLを追加する。
- 磁気ラックに洗浄された伸長複合体の残りの90 μLを含むチューブを2分間入れ、上清を取り除き、BTBの90 μLでビーズを再サスペンドし、それぞれ1.5 mM ATPおよび1.5 mM CTPを補充した。30°Cで10分間インキュベートします。
- 90 μLの洗浄バッファーで1回洗浄し、ステップ1.5.4に記載されているように90μLの洗浄バッファーで再中断した後、伸長複合体の30μLを「25mer」チューブに移し、プロテネーゼKおよびグリコーゲンとのストップミックスの94 μLを追加します。
- 残りの60μLの伸び錯体を含むチューブを磁気ラックに2分間入れ、上清を取り除き、1.5 mM ATPと1.5 mM CTPのそれぞれ0.8 μLを補充したBTBの60 μLでビーズを再サスペンドします。
- 30°Cで10分間インキュベートし、セクション1.5.5のように60μLの洗浄バッファーで1回洗浄し、60μLの洗浄バッファーで再中断します。
- 2xサンプルから「29mer」チューブに30 μLを移し、プロテパネーゼKとグリコーゲンとのストップミックスの94 μLを追加するか、セクション2に進んでキャッピングアッセイを実行します。
- RNA精製および分析に進みます(セクション3)。
2. 人工伸び複合体をアッセイコトランスプリケートキャッピングに使用する
- ステップ 1.2.1 から 1.5.5 13 倍に説明する手順をスケールアップすることにより、23mers を含む洗浄された伸び縮複合体を生成します。これは12の反応+1余分のために十分です。
-
ポルII CTDリン酸化
- 洗浄した伸長複合体を含むチューブを磁気ラックに2分間入れ、上清を取り除き、1.5mM ATPの13 μLを補充したBTBの377 μLでビーズを再サスペンドします。
- +H と -H というラベルの付いた 2 つの新しいチューブをそれぞれ準備します。+H標識チューブに〜300 ng/μL TFIIHの3 μLを加え、標識されたチューブに-Hを加えて20mM HEPES-NaOH pH 7.9、20%グリセロール、100mM KCl、1mM EDTA、0.5mg/mLウビンムアルバムを添加する。
注:通常、ラット肝臓から精製したTFIIHを用いていますが、市販の組換えCdk7/サイクリンH/MAT1(TFIIHのキナーゼモジュールであるCAK)の反応を約0.6μg/反応で得ています。情報については、材料の表を参照してください。 - ステップ2.2.1から洗浄された伸長複合体の87 μLを、30°Cで10分のインキュベートするチューブに+Hおよび270 μLの洗浄伸長複合体を加えます。
- サンプルを磁気ラックに2分間置きます。過剰なヌクレオチドおよび非結合タンパク質を除去するには、それぞれ90 μLまたは270 μLの洗浄バッファーで+Hおよび-H反応で伸長複合体を洗浄する。
-
RNA キャッピング
- キャッピングミックスの87 μLで+Hと標識されたチューブ内の伸び複合体を再中断する(BTBは50 μM GTP(表10)を補充した)キャッピングミックスの261 μLで-Hと標識されたチューブ内の伸び複合体を再中断する。
- 5 ng CE+H、5 ng CE、15 ng CE、45 ng CEというラベルの付いた4つの新しいチューブを準備します。希釈キャッピング酵素(CE)を20mM HEPES-NaOH pH 7.9、20%グリセロール、100mM KCl、1mM EDTA、0.5mg/mLウシ血清アルブミンに希釈し、5ng CE/μL、15 ng CE/μL、または45ng CE/μLおよび45ng CE/μLおよび45ng CE/μLおよび45ng CE/μLおよび45ng CE/μLおよび各3μLを含む溶液を調製する。
- それぞれに94 μLのストップバッファ(2.1.1)を追加した12本の新しいチューブを準備します。
- TFIIHで処理した伸び錯複合体の87 μLを加えて各キャッピング反応を開始するか、キャッピング酵素を含む標識チューブに加えないようにする。熱ブロックで30°Cでインキュベートします。
- 1、2、または4分後、各反応混合物の30μLを94μLのストップバッファーを含むチューブに転写して反応を停止する。セクション3に記載されているように反応産物を精製し、分析する。
3. RNA精製・分析
- RNA を浄化する
- 反応物を室温で20分間停止バッファー内でインキュベートする。
注:一時停止ポイント。このバッファー内のサンプルは、RNAの損失または分解なしに最大4時間維持されています。 - 124 μLのフェノールで1回抽出:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)とクロロホルムで1回:イソアミルアルコール(24:1)。
注意:フェノールは非常に有毒であり、急速に皮膚に吸収されます。適切な保護具を着用してください。
注:抽出中のRNAの回収を最大化するには、水性相と有機相の間に安定した障壁を形成する高密度ゲルを含む市販のチューブを使用します。「ディスカッションと資料の表」を参照してください。 - 水位相(最上層)を、3M酢酸ナトリウムpH 5.2の12.4 μLを含む新しいチューブに移します。
- 反応物を室温で20分間停止バッファー内でインキュベートする。
- エタノール沈殿
- 100%エタノールの350 μLを追加し、反転によって完全に混合します。
- ドライアイスで少なくとも10分間インキュベートします。
注:一時停止ポイント。便宜上、ここで停止し、翌日に手順を完了することができます。ただし、ステップ3.3に直接進み、同じ日にゲルを実行することが可能です。RNAは、さらなる処理の前に数日間-80°Cで保つことができますが、より長い時間放置しないでください。
- ゲル電気泳動用RNAサンプルの調製
- サンプルを解凍し、2~3回反転させて混合し、21,000 x g、4 °C、卓上遠心分離機で15分間遠心分離機を使用します。一方、脱電ゲルミックス(セクション3.4.1)を設定する。
- ペレットを邪魔することなく、サンプルからエタノールを慎重に除去します。
- 70%エタノールの500 μLを加え、チューブを数回反転させてペレットを洗浄し、室温または4°Cで5分間21,000 x gで再度遠心分離機を行います。
- できるだけ多くのエタノールを取り除き、テーブルトップ遠心分離機でチューブのクイックスピン(5-10 s)を行います。次に、ゲルローディングチップで、エタノールの最後の残りの体積を取り除きます。
- 室温で3分間エアドライペレット。
- 各ペレットの上部にH2Oの4 μLを加えてRNAを溶解する。室温で5分インキュベートします。
- ミックスに2x RNA色素の4 μL(材料表参照)を加え、各チューブを数秒間渦で渦にしてRNAを完全に再中断します。
注:後者は低温で沈殿するので、尿素の代わりにホルムアミドを含むRNA色素が推奨される。 - チューブを素早く回転させ、70°Cで10分間加熱します。
-
チューブをジェルにロードする準備ができるまでドライアイスに保存します。
注:ドライアイス上にRNAを保持すると、ゲルが重合している間、他の実験で柔軟に作業できます。サンプルは解凍後に再加熱する必要はありません。しかし、ゲルを実行する準備ができていれば、加熱後に直接RNAをロードすることができます。
- 尿素ページゲルの準備
- 40 mLゲルミックスの場合は、50 mLの円錐形チューブで組み合わせます:尿素の16.7g、40%のビス:アクリルアミド溶液の15 mL(19:1比)、10x TBEの4mL(1Mトリス-HCl、1Mホウ酸塩、20mMEDTA)、および8 mLのH2 OのmL。この容積は1.0 mmスペーサーが付いている1つの標準的なサイズのゲル(18 cmの高さx 16 cmの幅)のために十分である。
注意:アクリルアミドは非常に有毒です。溶液中に吸入のリスクはありませんが、取り扱い中は必ずラボコート、手袋、安全メガネを着用してください。
注:この混合物は、15〜50 ntの間で容易にRNAを解決する変性15%ポリアクリルアミドゲルを鋳造するためのもので、異なる長さの異なるRNA転写物を解決するために必要に応じてビス/アクリルアミドの濃度を変更する。 - 尿素が完全に溶解するまで、ゲルミックスを含む閉じたチューブをヌタターに置きます。
- ガラス板、1mmスペーサー、15ウェル櫛でゲル鋳造ステーションを設置します。
- 迅速に動作し、TEMEDの40 μLと10%のアンモニウム過硫酸溶液の400 μLをゲル溶液に加え、よく混合します。25 mLピペを使用して、プレート間にゲル溶液を注ぎ、櫛を挿入し、ゲルが少なくとも2時間重合することを可能にする。
注:使用前に2時間以上注いだ場合は、湿ったペーパータオル(櫛を所定の位置に残す)で覆い、ラップで包んで乾燥を防ぎます。
- 40 mLゲルミックスの場合は、50 mLの円錐形チューブで組み合わせます:尿素の16.7g、40%のビス:アクリルアミド溶液の15 mL(19:1比)、10x TBEの4mL(1Mトリス-HCl、1Mホウ酸塩、20mMEDTA)、および8 mLのH2 OのmL。この容積は1.0 mmスペーサーが付いている1つの標準的なサイズのゲル(18 cmの高さx 16 cmの幅)のために十分である。
- rna 電気泳動の脱電性ゲル
- 重合後、ゲルを走行タンクに移し、1x TBEで20mAで15〜30分間前走します。
- 一方、サンプルを解凍し(凍結した場合)、渦、2,000 x g、4°Cで4分間回転させます。
- 準備ができたら電源を切り、注射器を使用して1x TBEで各井戸を慎重にすすいでください。
- ゲルローディングのヒントを使用して、サンプルをゲルにロードします。
- 約2時間または低い色素(キシレンシアノールFF)がゲルの底に達するまで、一定の20〜30 mAでゲルを実行します。
- ゲルを取り出し、吸収性紙の上に置き、ラップで包みます。
- 放射標識されたゲルを蛍光スクリーンにさらす。
- 蛍光体を用いて蛍光スクリーンをスキャンし、画像を解析する。
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Representative Results
図2および図3は、異なる供給源から拡張またはPol IIを拡張することによって異なる長さの転写物を含む人工伸長複合体を生成するために使用される代表的な結果反応を示す。図4は、これらの伸長複合体を共写性CTDリン酸化依存性RNAキャッピングのアッセイにどのように使用できるかを示す。
図2Aは、人工伸長複合体におけるDNAおよびRNA分子の図である。図2Bは、プロトコル1に記載されているとおりに行われた反応で生成された異なる長さの転写物を示し、開始人工伸長複合体を20ntの合成RNAオリゴを用いて調製した(図2Aの濃い青色);RNA_20mer,表1)開始RNA長とDNAテンプレート配列がわかっているので、テンプレートに沿ってポルIIを歩くために必要なヌクレオチドのサブセット(ATP、CTP、GTP、UTP)を決定できます。新たに合成されたヌクレオチドの数を、最終的な予想長(RNAオリゴサイズ+添加ヌクレオチド数)を決定するために、RNAオリゴヌクレオチドプライマーの開始サイズに添加する。ATPおよびUTPの存在下で、Pol IIは20nt RNAオリゴに3ntを添加し、23mer RNAを含む伸び錯体を生成することができる。1つは、組み込まれられていないATPとUTPを洗い流し、その後、ATPとCTPを追加した場合、20 ntオリゴは2ntで25merを作るために拡張され、再び未組み込みのヌクレオチドを洗い流し、ATPとGTPを追加した場合、トランスクリプトは29merを作るためにさらに4 ntを拡張します。新たに生成された転写物は予想されるRNAサイズに対応しており、放射性標識付き23mersのほぼすべてが定量的に長い製品に追いかけることができるので、この方法(i)を使用すると、RNAオリゴがPol II出口に正しく配置されることを知っています。組み立て中のチャネルおよび(ii)放射標識付きRNAは、アクティブなPol II伸長複合体に関連付けられています。
図2Cは、開始伸長複合体が同じDNAテンプレートと非テンプレート鎖オリゴとRNAオリゴ(RNA_29mer、表1)を用いて調製したプロトコルのバリエーションを示す。その5'-終端が、それ以外の場合は20 nt RNAオリゴと順序で同一である。この場合、開始RNAの長さは29ntであるため、上記と同じPol II歩行ステップを使用して、32mer、34mer、および38mer転写物を含む伸長複合体を生成することができる。
分析の範囲に応じて、この方法はPol IIのソースの柔軟性を可能にします。図3では、異なるソースからのPol IIを用いて反応を比較する。最初の4レーンに示された反応では、人工伸長複合体を内因性、野生型Pol IIでラット肝臓または核分裂酵母から精製し、上述のように歩いて23mersまたは25mersを生成した。これらの反応に用いられるラット及び核分裂酵母Pol IIを、複数のクロマトグラフィーステップを用いてほぼ均質性に精製した。
この方法は、単純なワンステップ精製方法を用いて調製された野生型または変異型Pol IIを含む人工伸び複合体を生成するためにも使用することができる。図の最後の2レーンは、そのRpb1サブユニットにCTDを欠いているヒトPol IIの変異型を用いて行われたアッセイを示し、これはPol II触媒活性には必要ないが、RNAキャッピングに転写を組み合すのに役立つ。これらのアッセイに用いられるCTDレスPol IIは、フラグエピトープタグ付きバージョンのRpb1を発現するヒト細胞株からの抗FLAG免疫精製により精製した。活性Pol IIの濃度は調製から調製までさまざまです。したがって、反応に使用されるPol IIの量を変化させ、所望の活性を得るために必要な量を決定する初期実験を行うことが不可欠である。
図4は、Pol IIを含む人工伸長複合体に関連する放射性標識転写物のキャッピングとリン酸化または非リン酸化CTDを比較するアッセイの代表的な例を示す。これらのアッセイについて、5'-三リン酸末端を有する23ヌクレオチド転写物を含む伸長複合体は、プロトコル2に記載されているように調製した。
キャッピング酵素を有する伸長複合体のインキュベーションは、約1ntの移動シフトを引き起こし、5'キャップ14,15の添加を示す。キャッピング反応を定量するために、1つはキャッピング効率を決定し、上限が付いているRNAのパーセントとして表される。キャッピング効率は、総RNAに対するキャッピングRNAの比率を、最大得可能なキャッピングで割ったものです。我々のアッセイでは、市販の供給源から得られたRNAオリゴの最大得可能なキャッピングは〜85%であり、合成RNAの不完全な三リン酸化に起因する可能性が高い。
最初の3レーンに示された反応では、伸長複合体を一般的な転写因子TFIIHおよび共因子ATPでインキュベートし、キャッピング前にPol II CTDをリン酸化した。これらの反応では、キャッピング酵素を5ng添加した後、最大キャッピング付近が約1分観察された。TFIIHでインキュベートされず、従って非リン酸化Pol IIを含む伸長複合体を用いてアッセイを行った場合、同様のレベルのキャッピングを観察するのに約10倍のキャッピング酵素が必要でした。図4の最後の2車線は、TFIIHの存在下で、カッピング酵素の有無にかかわらず伸長複合体をインキュベートした反応の産物を示す。重要なことに、この図で示す人工伸び複合体の共写転写キャッピングのTFIIH依存性は、より複雑な酵素系のプロモーターで転写を開始した伸長複合体で観察されたものと非常によく似ている。5.
図1:人工伸長複合体の組み立て(A) 20 ntのRNAオリゴ(ダークブルー)は、9ntの相補配列を介してDNAテンプレート鎖(緑色)にアニールされ(B)RNAポリメラーゼII(Pol II)が、RNA3'終端をPolI触媒部位に位置するアニールDNA:RNAハイブリッドと混合される。(C)3'ビオチン化非テンプレート鎖DNAオリゴ(水色)のモル過剰を反応ミックスに添加し、伸び複合体をさらに安定化させる。(D)固定化伸長複合体は、余分なオリゴを除去するために洗浄され、ヌクレオチドの適切な組み合わせでインキュベートされ、Pol IIがRNAオリゴを所望の長さに延長することを可能にする。RNAの新しく合成された部分は黄色で示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:異なる長さのRNAオリゴを用いて歩くポルII。(A) 人工伸び複合体の図, 散歩中に追加されたヌクレオチドを示す.非テンプレート鎖およびテンプレート鎖DNAは、それぞれ水色と緑色で示されている。20 nt RNAオリゴは濃い青色で示されている。また、連続した歩行中に添加されたヌクレオチドが23mer RNA(オレンジ)、25mer RNA(茶色)、および29mer RNA(マゼンタ)を生成する。(B)プロトコル1に記載されているように、20nt RNAプライマーを用いてPol IIを歩行した後に得られた定義された長さのRNAを示す未成熟ゲル電気泳動。プロトコルの各順次歩行ステップ中に添加されたヌクレオチドは、色分けされたオレンジ色(23mer)、茶色(25mer)、およびマゼンタ(29mer)である。 (C)Pol IIは29nt RNAプライマーから始まり、それ以外の場合はB.(BおよびC)に示すように正確に同じゲルの一部を示すが、図示のために分離された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:野生型または変異型Pol IIを含む人工伸長複合体によって合成された転写物。人工伸長複合体は、ラット肝臓または核分裂酵母またはFLAG免疫精製Pol IIから20nt RNAプライマーを用いて組み立てられ、HeLa細胞からRpb1を欠いている(F:Rpb1-ΔCTD)。各複合体におけるRNAは、さらに23ntまたは25ntに拡張された。詳細については、テキストを参照してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:共写性RNAキャッピングのリン酸化依存性活性化。ラット肝臓Pol IIおよび放射標識23mer RNAを含む人工伸長複合体をATPおよび一般的な転写因子TFIIHまたは緩衝液で10分間インキュベートし、Pol II CTDをリン酸化した。洗浄後、伸長複合体を1、2または4分間の哺乳動物キャッピング酵素の5ng、15ng、または45ngでインキュベートし、230人を脱電性ゲル(上、最初の12レーン)で分解し、%キャップRNAを定量してプロットした(下)。図のこの部分は、もともと CC-BY ライセンスの下でオープン アクセス記事として公開された ref 5で公開されました。別の実験から来る最後の2つのレーンは、TFIIHの存在下で、伸長複合体がキャッピング酵素の有無にかかわらずインキュベートされた反応の産物を示しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| シーケンス | コメント | |
| RNA_20mer | アカウカウグクガグクア | 5' 三リン酸修飾;ページ&RP-HPLC精製 |
| RNA_29mer | アクアウガクークーグガウグクア | 5' 三リン酸修飾;ページ&RP-HPLC精製 |
| テンプレートストランドDNA | カッグッタグットカッグタックッタットトトガア タアグカッタッグ |
デュアルページ&HPLC精製 |
| 非テンプレートストランドDNA | アッカガアガットグタグガッタッタッタ | 5' TEG-ビオチン化;HPLC精製 |
表1:DNAおよびRNAオリゴヌクレオチド
| 最終濃度 | ボリューム | |
| トリス HCl pH 7.5 | 12 mM* | |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1 μL |
| 300 mM KCl | 50 mM | 1.67 μL |
| 10 μM テンプレートストランド DNA オリゴ 100 mM トリス-HCl pH 7.5 | 1 μM | 1 μL |
| 10 μM RNA オリゴ 10 mM トリス-HCl pH 7.5 で |
2 μM | 2 μL |
| 水 | 4.33 μL | |
| 10 μL | ||
| *すべてのトリス-HClはDNAおよびRNAオリゴ溶液から来る | ||
表2:DNAとRNAオリゴを焼くカクテル
| ポル II バッファ | 最終濃度 | ボリューム/反応 |
| 水 | 4.52 μL | |
| 50 mM MgCl2 | ^4.67 mM | 1.40 μL |
| 250 mM トリス HCl、pH 7.5 | ^23 mM | 1.40 μL |
| 300 mM KCl | *27 mM | 1.33 μL |
| 50% グリセロール | 3% | 0.9 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0.5 mg/ml | 0.38 μL |
| 100 mM DTT | 0.5 mM | 0.08 μL |
| 10% PVA | 2% | 3 μL |
| 13 μl | ||
| バッファ追加を使用する直前: | ||
| アニールされたテンプレート鎖DNA:RNA(表1より) | 1 μL | |
| RNA ポリメラーゼ II | 1 μL | |
| *ミックスの最終的なKCl濃度は〜50 mMであり、追加のKClはPol IIから来る | ||
| ^最終MgCl2およびトリスHCl濃度はそれぞれ5mMおよび25 mMであり、 | ||
| 付加的なMgCl2およびトリスHClはアニールされたDNA:RNAプロダクトから来る。 | ||
表 3: ポル II ミックス
| 非テンプレート DNA バッファー | 最終濃度 | ボリューム/反応 |
| 水 | 4.48 μL | |
| 300 mM KCl | *43.33 mM | 2.17 μL |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1.50 μL |
| 250 mM トリス HCl、pH 7.5 | 25 mM | 1.50 μL |
| 50% グリセロール | 3% | 0.9 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0.5 mg/ml | 0.38 μL |
| 100 mM DTT | 0.5 mM | 0.08 μL |
| 10% PVA | 2% | 3 μL |
| 14 μL | ||
| バッファ追加を使用する直前: | ||
| 5 μM ビオチン化非テンプレートDNAオリゴ | 1 μL | |
| *ミックス中の最終KCl濃度は50mMであり、追加のKClは非テンプレートDNAオリゴバッファーから来る。 | ||
表 4: 非テンプレート DNA ミックス
| パルスラベリングバッファ | 最終濃度 | ボリューム/反応 |
| 水 | 9.98 μL | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 5 μL |
| 50% グリセロール | 3% | 1.5 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0.5 mg/ml | 0.63 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0.4 μL |
| 1 M トリス HCl、pH 7.9 | *12 mM | 0.3 μL |
| 100 mM DTT | 0.5 mM | 0.13 μL |
| 1 M ヘペスナオ、pH 7.9 | 3 mM | 0.08 μL |
| 10% PVA | 2% | 5 μL |
| 23 μL | ||
| バッファ追加を使用する直前: | ||
| 15 μM ATP | 0.6 μM | 1 μL |
| 3.3 μM [α-32P]UTP | 0.13 μM | 1 μL |
| *ファイナルトリスHCl濃度は20mMで、ヌクレオチドバッファーから追加のトリスHClが付属しています。 | ||
表 5: パルス ラベリング NTP ミックス
| チェイス バッファ | 最終濃度 | ボリューム/反応 |
| トリス HCl、pH 7.5 | *30 mM | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 1 μL |
| 水 | 0.6 μL | |
| 50% グリセロール | 3% | 0.3 μL |
| 10 mM DTT | 0.5 mM | 0.25 μL |
| 100 mM ヘペスナオ、pH 7.9 | 3 mM | 0.15 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0.5 mg/ml | 0.13 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0.08 μL |
| 10% PVA | 2% | 1 μL |
| 3.5 μL | ||
| バッファ追加を使用する直前: | ||
| 100 μM UTP, 100 μM ATP 希釈 100 mM トリス-HCl, pH 7.5 | 5 μM | 1.5 μL |
| *すべてのトリスHClはヌクレオチドバッファーから来る |
表 6: チェイス NTP ミックス
| 最終濃度 | ボリューム/反応 | |
| 水 | 24.21 μL | |
| 1 M KCl | 60 mM | 1.8 μL |
| 50% グリセロール | 3% | 1.8 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0.5 mg/mL | 0.75 μL |
| 1 M トリス HCl、pH 7.9 | 20 mM | 0.6 μL |
| 10% PVA | 0.2パーセント | 0.6 μL |
| 100 mM DTT | 0.5 mM | 0.15 μL |
| 1 M ヘペスナオ、pH 7.9 | 3 mM | 0.09 μL |
| 30 μl |
表 7: 洗浄バッファ
| 最終濃度 | ボリューム/反応 | |
| 水 | 14.13 μL | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 6 μL |
| 50% グリセロール | 3% | 1.8 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0.5 mg/ml | 0.75 μL |
| 1 M トリス HCl、pH 7.9 | 20 mM | 0.6 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0.48 μL |
| 100 mM DTT | 0.5 mM | 0.15 μL |
| 1 M ヘペスナオ、pH 7.9 | 3 mM | 0.09 μL |
| 10% PVA | 2% | 6 μL |
| 30 μL |
表 8: 基本書き起こしバッファ (BTB)
| バッファの停止 | 最終濃度 | ボリューム/反応 |
| 水 | 55.74 μL | |
| 1 M トリス HCl、pH 7.5 | 10 mM | 0.6 μL |
| 5 M ナクル | 300 mM ナクル | 3.6 μL |
| 500 mM エダ | 0.5 mM エダ | 0.06 μL |
| 10% SDS | 0.2% SDS | 1.2 μL |
| 60 μL | ||
| バッファ追加を使用する直前: | ||
| 15 mg/mL グリコーゲン | 2 μL | |
| 20 mg/mL プロテキンゼ K | 2 μL | |
| 水 | 30 μL | |
表 9: ミックスの停止
| 最終濃度 | ボリューム/反応 | |
| 水 | 11.9 μL | |
| 300 mM KCl | *53.33 mM | 5.33 μL |
| 50% グリセロール | 3% | 1.8 μL |
| 1.5 μM GTP を 100 mM トリス HCl で希釈、pH 7.5 | 50 μM | 1 μL |
| 100単位/mL 無機ピロホスファターゼ、酵母 | 0.1単位/反応 | 1 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0.5 mg/ml | 0.75 μL |
| 1 M トリス HCl、pH 7.9 | ^16.67 mM | 0.5 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0.48 μL |
| 100 mM DTT | 0.5 mM | 0.15 μL |
| 1 M ヘペスナオ、pH 7.9 | 3 mM | 0.09 μL |
| 10% PVA | 2% | 6 μL |
| 29 μL | ||
| バッファ追加を使用する直前: | ||
| キャッピング酵素 | 1 μL | |
| *ミックス中の最終KCl濃度は~60mMで、キャッピング酵素とピロホスファターゼから追加のKClが付属しています | ||
| ^ファイナルトリスHCl濃度は20mMで、ヌクレオチドバッファーから追加のトリスHClが発生します。 | ||
表 10: キャッピングミックス
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Discussion
RNA処理や転写伸長自体の調節などのPol II伸長複合体に結合した事象を解剖しようとする研究は、高度に精製された酵素系を用いることによって大いに促進することができる。このような酵素システムの設定は困難な場合があります。Pol IIによるプロモーター依存転写には、少なくとも5つの一般的な転写因子が必要である。これらの要因の準備と備蓄には数ヶ月かかる場合があります。したがって、このプロセスにおけるレート制限ステップは、多くの場合、試験管内の基底転写を再構成するために必要な転写因子の幹部を単に準備する。
本稿では、精製されたPol IIと合成DNAとRNAオリゴヌクレオチドのみを用いて、人工転写伸長複合体2、3を生成するための以前に開発された方法の適応について説明する。得られた伸長複合体は転写活性であり、Pol II転写およびRNAキャッピング5の結合を調査する場合の使用に適している。転写とRNAキャッピングは、クロマチンおよびこの定義された酵素系に存在しない他の多くのタンパク質のコンテキストで生体内で起こることに注意することが重要です。したがって、このシステムは、生体内で発生する反応の多くの特徴(すべてではない)を要約することが期待されます。我々が説明するプロトコルは、磁気ビーズに結合された生体化されたDNAを介して人工伸長複合体を固定することにより、研究者が反応条件を容易に変更し、非組み込みヌクレオチドを除去することを可能にすることによって、以前の方法に基づいて構築されていますアッセイの異なる段階の間に。重要なのは、伸長複合体を固定するために使用されるタグは、Pol II自体またはテンプレート鎖ではなく、DNAの非テンプレート鎖の一方の端にあるため、完全な伸長複合体に関連するPol IIのみがビーズ上に保持されます。
生まれつき転写物は、キャッピング酵素によって修飾するために5'-三リン酸末端を有する必要があるため、キャッピング実験に使用される合成RNAオリゴヌクレオチドは、5'-三リン酸テルミニで購入される。しかし、未修飾RNAオリゴは、他の共写性RNA処理イベントの研究またはPol II伸長を調節する転写因子の活性を含む他の用途に使用することができる。下流のアプリケーションにかかわらず、精製性の高いDNAとRNAオリゴを用いて伸び性複合体を組み立てすることをお勧めします。特に、ビオチン化DNAオリゴはHPLCによって精製されるべきであり、他のDNAおよびRNAオリゴはポリアクリルアミドゲル電気泳動および/またはHPLCによって精製されるべきである。しかし、酵素活動の純度は、ケースバイケースで決定する必要があり、各実験の範囲に依存します。
組み立ての最後のステップで非テンプレート生物化化DNAオリゴを添加することは、原則として、三次複合体を得るのに十分であるべきである。しかし、我々は常にPol IIが正しい数のヌクレオチドを組み込むことを確認するために少なくとも1つの「歩行」ステップを含む:実験の目的は、同転写キャッピングまたは他のRNA処理ステップをアッセイするための基板を生成すること、またはPol IIに従うことである場合長伸、我々は常に転写物を視覚化し、その後の歩行ステップのためにラベルのない「コールド」ヌクレオチドを使用できるように、最初の「歩行」に32P標識リボヌクレオチドを含み、異なる長さの転写物の特定の活動を行います。は一定のままです。このプロトコルで説明する方法は、32個のP標識ヌクレオチドを使用して生まれ変わらず転写物を可視化しますが、蛍光ベースのアッセイは、放射性物質を使用できない場合にRNA標識を測定するために使用することができます。しかし、このようなアッセイの感度は、通常、放射性ラベルを使用するものよりもはるかに少なく、通常は大量の酵素を必要とすることに注意することが重要です。
再現可能な実験のための重要なステップは、フェノール:クロロホルム:イソアミル抽出およびエタノール沈殿時の良好なRNA回収である。フェノールに高密度ゲルを含むマイクロ遠心管(材料表参照)を用いると、この工程から核酸の再現性と収率が向上することがわかりました。また、エタノール沈殿時に着色グリコーゲン(材料表参照)を担体として使用すると、小さな核酸ペレットが見やすくなり、除去時にペレットを吸引してペレットを失う可能性が低くなります。エタノール上清。
我々が説明するものと同様のプロトコルを使用して生成された人工伸長複合体は、Pol II伸長複合体と転写を調節する因子との間のタンパク質またはタンパク質核酸相互作用の測定にも有用であるべきであると考えられる。伸びにリンクされた伸びまたはRNA処理イベント。この場合、洗浄後に人工伸び複合体に結合したままのタンパク質は、西洋ブロッティングまたは質量分析によって検出されます。放射線標識RNAは必要ありませんし、我々は唯一の「冷たい」ヌクレオチドですべての転写ステップを行います。
最後に、この方法は転写複合体の構造解析に使用できる可能性があります。実際、関連する方法は、酵母および哺乳動物酵素を用いてクライオEM研究で使用され、カッピング酵素-Pol II相互作用13、および伸長時に他のタンパク質またはタンパク質複合体とのPol IIの相互作用12、一時停止16,17, そして最近, ヌクレオソーム18にバインド.この方法を使用して生成された転写複合体の構造解析のための可能な合併症は、複合体からビオチン/磁気ビーズを除去する必要性です。しかしながら、これは、制限酵素によって認識されるDNAオリゴス特異的部位に含むか、UV線処理後に切り離されたビオチンリンカーを用いることによって解決することができる19。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
私たちは、哺乳類キャッピング酵素cDNAを提供してくれたS.シューマンに感謝します。この研究は、グレーター・カンザスシティ・コミュニティ財団のヘレン・ネルソン医学研究基金からのスタワーズ医学研究所への助成金によって一部支援されました。 この原稿の根底にある元のデータは、http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434のスタワーズオリジナルデータリポジトリからアクセスできます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
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