कृत्रिम आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय विस्तार परिसर को-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए प्रोसेसिंग इवेंट्स को अलग करने के लिए
Summary
यहाँ, हम आरएनए पॉलिमरेज II (पोल II) दीर्घीकरण परिसरों की असेंबली का वर्णन करते हैं जिसमें केवल कम कृत्रिम डीएनए और आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड और शुद्ध पोल II की आवश्यकता होती है। ये परिसर पोल द्वितीय दीर्घीकरण परिसर के साथ जुड़े प्रतिलिपिके सह-लेखनीय प्रसंस्करण अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं।
Abstract
यूकैरियोटिक एमआरएनए संश्लेषण एक जटिल जैव रासायनिक प्रक्रिया है जिसमें बहु-सबयूनिट एंजाइम आरएनए पॉलिमरेज II और सह-ट्रांसक्रिप्शनल कैपिंग और पूर्ववर्ती आरएनए के एप्लिकेशन द्वारा एक पूर्ववर्ती आरएनए में डीएनए टेम्पलेट के प्रतिलेखन की आवश्यकता होती है ताकि परिपक्व एमआरएनए का निर्माण किया जा सके। MRNA संश्लेषण के दौरान, आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय दीर्घीकरण परिसर प्रतिलेखन कारकों का एक बड़ा संग्रह है कि अपनी उत्प्रेरक गतिविधि को नियंत्रित द्वारा विनियमन के लिए एक लक्ष्य है, साथ ही कैपिंग, splicing, और 3′ प्रसंस्करण एंजाइमों कि परिपक्व MRNA बनाने. MRNA संश्लेषण के अंतर्निहित जटिलता के कारण, सरल प्रयोगात्मक प्रणालियों अलगाव को सक्षम करने और इसके विभिन्न सह-transcriptional चरणों की जांच महान उपयोगिता है.
इस अनुच्छेद में, हम एक ऐसे सरल प्रयोगात्मक सह-प्रतिलेखन आरएनए कैपिंग की जांच के लिए उपयुक्त प्रणाली का वर्णन. यह प्रणाली शुद्ध पॉलिमरेज और कृत्रिम प्रतिलेखन बुलबुले से इकट्ठे परिभाषित आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय दीर्घीकरण परिसरों पर निर्भर करता है। जब biotinylated डीएनए के माध्यम से स्थिर, इन आरएनए polymerase द्वितीय बढ़ाव परिसरों सह-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए कैपिंग और तंत्र जिसके द्वारा बढ़ाव जटिल रंगरूटों और को नियंत्रित करता है कैपिंग एंजाइम विच्छेदन के लिए एक आसानी से manipulable उपकरण प्रदान करते हैं सह-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए कैपिंग। हम आशा करते हैं कि इस प्रणाली को भर्ती और/या प्रोटीन परिसरों के संयोजन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें आरएनए परिपक्वता के अन्य चरणों में भूमिकाओं के साथ आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय दीर्घीकरण परिसर में जोड़ा जा सकता है।
Introduction
यूकैरियोटिक दूत आरएनए (एमआरएनए) संश्लेषण एक विस्तृत जैव रासायनिक प्रक्रिया है जिसमें आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय द्वारा एक अप्रसंस्कृत अग्रदूत आरएनए का संश्लेषण और परिपक्व एमआरएनए को उत्पन्न करने के लिए पूर्ववर्ती आरएनए के प्रसंस्करण शामिल है। कैपिंग, स्पेलिंग, और पॉलीएडेनिलेशन के आरएनए प्रसंस्करण चरणों को काफी हद तक सह-प्रतिलेखन किया जाता है। पोल द्वितीय बढ़ाना परिसर एक पाड़ है कि भर्ती और आरएनए प्रसंस्करण एंजाइमों के कई की गतिविधियों आर्केस्ट्रा के रूप में कार्य करता है. नतीजतन, कैसे परिपक्व यूकैरियोटिक mRNAs उत्पन्न कर रहे हैं की हमारी अंतिम समझ प्रयोगात्मक प्रणालियों के विकास पर भारी निर्भर करेगा बढ़ाव परिसर में भर्ती अंतर्निहित जैव रासायनिक तंत्र के विच्छेदन की अनुमति और सह-ट्रांसक्रिप्शनल कैपिंग, स्पेलिंग, और पॉलीडेनिलेशन के लिए जिम्मेदार एंजाइमों का विनियमन।
आश्चर्य नहीं कि ऐसी प्रयोगात्मक प्रणालियों का विकास कठिन रहा है। एक प्रमुख बाधा पोल द्वितीय प्रतिलेखन की उल्लेखनीय जटिलता ही किया गया है, जहां बस इन विट्रो में पोल द्वितीय द्वारा बेसल प्रतिलेखन पुनर्गठन पांच सामान्य प्रतिलेखन दीक्षा कारकों की एक न्यूनतम सेट की आवश्यकता है: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, और TFIIH 1. इसके अलावा, विट्रो में विनियमित पोल द्वितीय प्रतिलेखन के किसी भी प्रकार के पुनर्गठन के लिए प्रतिलेखन कारकों और coregulators का एक भी बड़ा सेट की आवश्यकता है. इस प्रकार, एक प्रमुख लक्ष्य सक्रिय पोल द्वितीय दीर्घीकरण परिसरों पोल द्वितीय प्रतिलेखन और आरएनए प्रसंस्करण के कार्यात्मक युग्मन की जांच के लिए उपयुक्त के पुनर्गठन की अनुमति सरल प्रयोगात्मक प्रणालियों को विकसित करने के लिए किया गया है।
सक्रिय पोल द्वितीय दीर्घीकरण परिसरों के पुनर्गठन के लिए एक ऐसी सरल विधि लम्बी पोल द्वितीय के संरचनात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए उपयोगी साबित हो गया है और, और हाल ही में, सह-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए प्रसंस्करण की जांच के लिए2,3 ,4,5. इस लेख में, हम बताते हैं कि कैसे पोल द्वितीय बढ़ाव जटिल शुद्ध पोल द्वितीय और सिंथेटिक प्रतिलेखन बुलबुले से तैयार प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता है नवजात पोल द्वितीय प्रतिलिपि के सह-प्रतिलेखन कैपिंग अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए.
कैपिंग नवजात पोल द्वितीय प्रतिलिपि के 5′-triphosphate अंत करने के लिए एक 5′-guanosine “कैप” के सहसंयोजक जोड़ को संदर्भित करता है। यह टोपी एम आर एन ए परिपक्वता, परिवहन, अनुवाद तथा अन्य प्रक्रियाओं6,7 के बाद के चरणों के लिए महत्वपूर्णहै। टोपी एक एंजाइम कैपिंग एंजाइम के रूप में संदर्भित द्वारा पोल द्वितीय प्रतिलिपि करने के लिए सह-transcriptionally जोड़ा जाता है. स्तनधारी कोशिकाओं में, आरएनए 5′-ट्राइफॉस्फेटेज और कैपिंग एंजाइम की गुएनिल ट्रांसफरेज गतिविधियों के लिए जिम्मेदार सक्रिय साइटें एक पॉलीपेप्टाइड8के भीतर निहित होती हैं। कैपिंग एंजाइम पोल द्वितीय शरीर पर अभी तक परिभाषित सतहों के साथ बातचीत के माध्यम से पोल द्वितीय बढ़ाव परिसर में भर्ती किया जाता है और इसके हेप्टापटाइड के Ser5 पर Rb1 carboxy-टर्मिनल डोमेन (CTD) फॉस्फोरिलेटेड5दोहराता है। दीर्घीकरण परिसर में, कैपिंग एंजाइम एक 5′-गुआनोसाइन टोपी के अलावा उत्प्रेरक एक बार नवजात प्रतिलिपि कम से कम 18 न्यूक्लिओटाइड की लंबाई तक पहुँच जाता है और polymerase आरएनए निकास चैनल से उभरा है। कैपिंग प्रतिक्रिया के पहले चरण में, ट्राइफॉस्फेट hydrolyzes आरएनए 5′-ट्राइफॉस्फेट एक 5′-diphosphate उपज करने के लिए। दूसरे चरण में, GTP एक GMP कैपिंग एंजाइम मध्यवर्ती बनाने, guanylyl transferase द्वारा जीएमपी के लिए hydrolyzed है. अंत में, guanylyl transferase टोपी का उत्पादन करने के लिए नवजात प्रतिलिपि के 5′-diphosphate अंत करने के लिए जीएमपी स्थानान्तरण।
कैपिंग प्रतिक्रिया की एक उल्लेखनीय विशेषता यह है कि सह-ट्रांसक्रिप्शनल कैपिंग (यानी, कार्यात्मक पोल द्वितीय दीर्घीकरण परिसरों के साथ जुड़े प्रतिलिपियों की कैपिंग) मुक्त आरएनए5,9की कैपिंग की तुलना में अधिक कुशल है। इस प्रकार, क्षेत्र में एक बड़ा सवाल यह रहा है कि कैसे कैपिंग के इस नाटकीय सक्रियण पोल द्वितीय बढ़ाना परिसर के साथ कैपिंग एंजाइम की बातचीत के माध्यम से हासिल की है. इस प्रोटोकॉल में हम केवल शुद्ध आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय और कृत्रिम प्रतिलेखन बुलबुले का उपयोग कर सक्रिय आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय दीर्घीकरण परिसरों की विधानसभा का वर्णन करते हैं। इन विधियों को परिभाषित लंबाई और अनुक्रम की प्रतिलिपि के साथ आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय दीर्घीकरण परिसरों के निर्माण की अनुमति देते हैं। हाल ही में किए गए एक अध्ययन में हमने इन परिभाषित आरएनए पॉलिमरेज II दीर्घीकरण परिसरों का प्रयोग आरएनए कैपिंग5के तंत्र के पहलुओं की जांच करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया है। विशेष रूप से, हमने यह दिखाया कि (i) इन दीर्घीकरण परिसरों से संबद्ध आरएनए की कैपिंग मुक्त आरएनए को कैपिंग की तुलना में 100 गुना अधिक कुशल थी और (पप) पोल II सीटीडी के टीएफआईएच-निर्भर फॉस्फोरिलेशन द्वारा प्रेरित किया गया था। यहाँ वर्णित दृष्टिकोण सिद्धांत रूप में पोल द्वितीय दीर्घीकरण परिसर से जुड़े अन्य सह-प्रतिलेखन आरएनए प्रसंस्करण प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए substrates उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल की धारा 1 में, कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों एक सिंथेटिक टेम्पलेट किनारा डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड एक आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के लिए annealing द्वारा बनाई गई हैं कि इसके 3’अंत में पूरक है टेम्पलेट किनारा डीएनए के लगभग 9 न्यूक्लिओटाइड. पोल द्वितीय तो डीएनए पर भरी हुई है: RNA डुप्लेक्स. इसके बाद दीर्घीकरण परिसर आंशिक रूप से पूरक, गैर-टेम्पलेट किनारा डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के अतिरिक्त पूर्ण होता है जिसे बायोटिन के साथ इसके 3′-end में लेबल किया जाता है (चित्र 1 और चित्र 2A)। आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड को पोल II द्वारा इन दीर्घीकरण परिसरों में विस्तारित किया जाता है ताकि रेडियोलेबल न्यूक्लिओटाइड के उपयुक्त संयोजनों के अतिरिक्त परिभाषित लंबाई और अनुक्रम की रेडियोलेबल प्रतिलिपि बनाने के लिए। इसके अलावा, unincorporated न्यूक्लिओटाइड को दूर करने के लिए washes के संयोजन का उपयोग कर और न्यूक्लिओटाइड के विभिन्न संयोजनों के आगे इसके अलावा, एक डीएनए टेम्पलेट के साथ विभिन्न पदों के लिए पोल द्वितीय “चल” कर सकते हैं और परिभाषित लंबाई के आरएनए संश्लेषित. आरएनए को तब शुद्ध किया जाता है और यूरिया-पेज जैल में इलेक्ट्रोफोरोसिस के अधीन किया जाता है। प्रोटोकॉल के अनुभाग 2 में, कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों का उपयोग सह-प्रतिलेखन आरएनए कैपिंग का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। उदाहरण प्रस्तुत उपाय ों TFIIH-निर्भर फॉस्फोरिलेशन के प्रभाव पर पोल द्वितीय CTD सह-प्रतिलेखन आरएनए कैपिंग पर. इस प्रयोग में, हम एंजाइम सांद्रता (5, 15 और 45 एनजी प्रति प्रतिक्रिया) और समय (1, 2 और 4 मिनट) कैपिंग के एक समारोह के रूप में सह-ट्रांसक्रिप्शनल कैपिंग की सीमा को मापते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
अध्ययन है कि इस तरह के आरएनए प्रसंस्करण और प्रतिलिपि बढ़ाव के विनियमन के रूप में पोल द्वितीय बढ़ाव परिसर के लिए युग्मित घटनाओं विच्छेदन की तलाश में बहुत एक अत्यधिक शुद्ध एंजाइम प्रणाली के उपयोग से सुव…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम स्तनधारी कैपिंग एंजाइम cDNA प्रदान करने के लिए एस S. Shuman धन्यवाद. इस काम के भाग में ग्रेटर कैनसस सिटी सामुदायिक फाउंडेशन में हेलेन नेल्सन चिकित्सा अनुसंधान कोष से चिकित्सा अनुसंधान के लिए Stowers संस्थान के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. इस पांडुलिपि अंतर्निहित मूल डेटा http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 पर Stowers मूल डेटा भंडार से पहुँचा जा सकता है.
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
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