Kunstig RNA polymerase II forlengelse komplekser for dissekere co-transcriptional RNA prosessering hendelser
Summary
Her beskriver vi monteringen av RNA polymerase II (Pol II) forlengelse komplekser som kun krever kort syntetisk DNA og RNA-oligonukleotider og renset Pol II. Disse komplekser er nyttige for å studere mekanismer underliggende co-transcriptional behandling av transkripsjoner knyttet til Pol II forlengelse kompleks.
Abstract
Eukaryote mRNA syntese er en kompleks biokjemiske prosess som krever transkripsjon av en DNA-mal til en forløper RNA av multi-delenhet enzym RNA polymerase II og co-transcriptional capping og skjøting av forløperen RNA å danne den modne mRNA. Under mRNA syntese, er RNA polymerase II forlengelse komplekset et mål for regulering av en stor samling av transkripsjon faktorer som styrer sin katalysator, samt capping, skjøting, og 3 ‘-prosessering enzymer som skaper den modne mRNA. På grunn av den iboende kompleksiteten i mRNA syntese, enklere eksperimentelle systemer muliggjør isolering og etterforskning av sine ulike co-transcriptional stadier har stor nytte.
I denne artikkelen beskriver vi en slik enkel eksperimentell system egnet for å undersøke co-transcriptional RNA capping. Dette systemet er avhengig av definerte RNA polymerase II forlengelse komplekser samlet fra renset polymerase og kunstige transkripsjon bobler. Ved immobilisert via biotinylated DNA gir disse RNA polymerase II forlengelse komplekser et lett manipulable verktøy for dissekere med transcriptional RNA-capping og mekanismer der forlengelse komplekse rekrutter og regulerer capping enzym under transcriptional RNA-capping. Vi forventer at dette systemet kan bli tilpasset for å studere rekruttering og/eller montering av proteiner eller protein komplekser med roller i andre stadier av mRNA modning koplet til RNA polymerase II forlengelse kompleks.
Introduction
Eukaryote Messenger RNA (mRNA)-syntese er en forseggjort biokjemiske prosess som involverer syntese av en ubehandlet forløper RNA ved RNA polymerase II og behandling av forløperen RNA for å gi den modne mRNA. RNA prosessering trinnene av capping, skjøting, og polyadenylation utføres i stor grad co-transcriptionally. Pol II forlengelse-komplekset fungerer som et stillas som rekrutterer og appartefakter aktivitetene til mange av RNA prosesserings enzymene. Følgelig, vår ultimate forståelse av hvordan modne eukaryote mRNAs genereres vil stole tungt på utviklingen av eksperimentelle systemer for å tillate Disseksjon av biokjemiske mekanismer underliggende rekruttering til forlengelse komplekse og regulering av enzymer ansvarlig for co-transcriptional capping, skjøting, og polyadenylation.
Ikke overraskende har utviklingen av slike eksperimentelle systemer vært vanskelig. Et stort hinder har vært bemerkelsesverdig kompleksiteten i Pol II transkripsjon selv der bare rekonstituering av basal transkripsjon av pol II in vitro krever et minimum sett av fem generelle transkripsjon innvielse faktorer: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, og TFIIH 1. dess, rekonstituering av noen form for REGULERT Pol II transkripsjon in vitro krever et enda større sett med transkripsjon faktorer og coregulators. Dermed har et stort mål vært å utvikle enklere eksperimentelle systemer slik rekonstituering av aktive Pol II forlengelse komplekser egnet for undersøkelser av funksjonell kopling av pol II transkripsjon og RNA prosessering.
En slik enklere metode for rekonstituering av aktiv Pol II forlengelse komplekser har vist seg nyttig for strukturelle og biokjemiske studier av elongating Pol II og, mer nylig, for å undersøke co-transcriptional RNA prosessering2,3 ,4,5. I denne artikkelen viser vi hvordan Pol II forlengelse komplekser tilberedt av renset Pol II og syntetisk transkripsjon bobler kan brukes effektivt for å undersøke mekanismene underliggende co-transcriptional capping av begynnende Pol II transkripsjoner.
Capping refererer til kovalente tillegg av en 5 ‘-guanosin “cap” til 5 ‘-trifosfat slutten av begynnende Pol II transkripsjoner. Hetten er viktig for påfølgende trinn av mRNA modning, transport, oversettelse, og andre prosesser6,7. Hetten er lagt co-transcriptionally til Pol II transkripsjoner av et enzym referert til som capping enzym. I pattedyrceller, aktive nettsteder ansvarlig for RNA 5 ‘-triphosphatase og guanylyl glutamyltransferase aktiviteter av capping enzymet er inneholdt innenfor en enkelt polypeptid8. Capping enzymet er rekruttert til Pol II forlengelse komplekse gjennom interaksjoner med ennå ikke er definert overflater på Pol II kroppen og Rpb1 carboxy-Terminal domene (CTD) fosforylert på Ser5 av sine heptapeptide gjentar5. I forlengelse komplekset, capping enzymet katalyserer tillegg av en 5-guanosin cap når begynnende transkripsjon når en lengde på minst 18 nukleotider og har dukket opp fra polymerase RNA exit kanal. I første trinn av capping-reaksjonen hydrolyzes triphosphatase RNA 5 ‘-trifosfat for å gi en 5-uridindifosfatglukuronosyltransferase. I det andre trinnet, er GTP hydrolysert til GMP av guanylyl glutamyltransferase, danner et GMP-capping enzym mellomliggende. Til slutt overfører guanylyl glutamyltransferase GMP til 5 ‘-uridindifosfatglukuronosyltransferase slutten av den begynnende transkripsjon å produsere hetten.
En bemerkelsesverdig trekk ved capping reaksjonen er at co-transcriptional capping (dvs. capping av transkripsjoner forbundet med funksjonell Pol II forlengelse komplekser) er mye mer effektivt enn capping av gratis RNA5,9. Således, et stort spørsmål i feltet har vært hvordan denne dramatiske aktiveringen av capping oppnås via interaksjoner av capping enzymet med Pol II forlengelse kompleks. I denne protokollen beskriver vi monteringen av aktive RNA polymerase II forlengelse komplekser med bare renset RNA polymerase II og kunstige transkripsjon bobler. Disse metodene tillater opprettelse av RNA polymerase II forlengelse komplekser med transkripsjoner av definert lengde og sekvens. I en fersk studie brukte vi disse definerte RNA polymerase II-forlengelse komplekser som modell for å undersøke aspekter ved mekanismene til RNA-capping5. Spesielt viste vi at (i) capping av RNA assosiert med disse forlengelse komplekser var mer enn 100-fold mer effektiv enn capping av fri RNA og (II) ble stimulert av TFIIH-avhengige fosforylering av pol II CTD. Tilnærmingen som beskrives her, kan i prinsippet tilpasses til å generere underlag for å studere andre transcriptional RNA-behandlings reaksjoner knyttet til Pol II-forlengelse komplekset.
I del 1 av denne protokollen, kunstige forlengelse komplekser er opprettet av annealing en syntetisk mal Strand DNA oligonukleotid til en RNA oligonukleotid som er komplementære på sitt 3 ‘-end til ca 9 nukleotider av malen Strand DNA. Pol II blir deretter lastet inn på DNA: RNA dupleks. Forlengelse komplekset blir deretter fullført ved tilsetning av en delvis utfyllende, ikke-mal Strand DNA-oligonukleotid som er merket med biotin på sitt 3 ‘-end (figur 1 og figur 2a). RNA-oligonukleotid utvides av pol II i disse forlengelse komplekser for å gjøre radiolabeled utskrifter av definert lengde og sekvens ved tilsetning av egnede kombinasjoner av radiolabeled nukleotider. I tillegg, ved hjelp av en kombinasjon av vasker for å fjerne næringsdrivende nukleotider og videre tillegg av ulike kombinasjoner av nukleotider, kan man “gå” Pol II til ulike posisjoner langs DNA malen og syntetisere RNA av definerte lengder. RNA blir deretter renset og utsatt for elektroforese i denaturering urea-side gels. I del 2 av protokollen brukes kunstige forlengelse komplekser til å analysere transcriptional RNA-capping. Eksempelet presentert måler effekten av TFIIH-avhengige fosforylering av pol II CTD på co-transcriptional RNA capping. I dette eksperimentet måler vi omfanget av co-transcriptional capping som en funksjon av capping enzym konsentrasjon (5, 15 og 45 ng per reaksjon) og tid (1, 2 og 4 min).
Protocol
Representative Results
Discussion
Studier det søke å analysere begivenheter koplet å Pol II forlengelse innviklet som RNA bearbeiding og reguleringen av utskriften forlengelse selv kan høyeste lettere ved bruk av en høylig renset enzym system. Sette opp slike enzym systemer kan være utfordrende. Promoter-avhengig transkripsjon av pol II krever minst fem generelle transkripsjon faktorer. Utarbeidelse og lagring av disse faktorene kan ta måneder; Derfor er det rate-begrensende trinn i denne prosessen ofte bare forbereder den av transkripsjon faktore…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker S. Shuman for å gi pattedyr capping enzymet cDNA. Dette arbeidet ble støttet delvis av et stipend til Stowers Institute for Medical Research fra Helen Nelson Medical Research Fund ved Greater Kansas City Community Foundation. Opprinnelige data underliggende dette manuskriptet kan nås fra Stowers opprinnelige data repository på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
