Complexos artificiais de alongamento de RNA polimerase II para dissecar eventos co-transcricionais do processamento de RNA
Summary
Aqui, nós descrevemos o conjunto de complexos do alongamento do polymerase II (pol II) do RNA que exigem somente o ADN sintético curto e oligonucleotídeos do RNA e o pol purificado II. Esses complexos são úteis para estudar mecanismos subjacentes ao processamento cotranscricional de transcrições associadas ao complexo de alongamento pol II.
Abstract
A síntese eucariótica do mRNA é um processo bioquímico complexo que exige a transcrição de um molde do ADN em um RNA do precursor pela enzima do RNA polymerase II do multi-subunit e o nivelamento e a emenda co-transcriptional do RNA do precursor para dar forma ao mRNA maduro. Durante a síntese de mRNA, o complexo de alongamento da RNA polimerase II é um alvo para regulação por uma grande coleção de fatores de transcrição que controlam sua atividade catalítica, bem como as enzimas de nivelamento, splicing e 3 ‘-Processing que criam o mRNA maduro. Por causa da complexidade inerente da síntese de mRNA, os sistemas experimentais mais simples que permitem o isolamento e a investigação de seus vários estágios co-transcriptional têm a grande utilidade.
Neste artigo, nós descrevemos um tal sistema experimental simples apropriado para investigar o tampar co-transcriptional do RNA. Este sistema confia nos complexos definidos do alongamento do polymerase II do RNA montados da polimerase purificada e das bolhas artificiais da transcrição. Quando imobilizados via DNA biotinilado, estes complexos de alongamento de RNA polimerase II fornecem uma ferramenta facilmente manipulável para dissecação de RNA de encapsulamento co-transcricional e mecanismos pelos quais o complexo de alongamento recruta e regula a enzima tampando durante capping co-transcriptional do RNA. Antecipamos que este sistema poderia ser adaptado para o estudo do recrutamento e/ou montagem de proteínas ou complexos proteicos com papéis em outros estágios de maturação do mRNA acoplados ao complexo de alongamento da RNA polimerase II.
Introduction
A síntese do RNA do mensageiro eucariótico (mRNA) é um processo bioquímico elaborado que envolva a síntese de um RNA precursor não processado pelo RNA polymerase II e Processando do RNA do precursor para render o mRNA maduro. As etapas de processamento do RNA de nivelamento, de emenda, e de poliadenilação são executadas pela maior parte co-transcripcionalmente. O complexo de alongamento pol II serve como um andaime que recruta e orquestra as atividades de muitas das enzimas de processamento de RNA. Conseqüentemente, nossa compreensão final de como os mRNAs eucarióticas maduros são gerados dependerá pesadamente no desenvolvimento de sistemas experimentais para permitir a dissecção dos mecanismos bioquímicos que subjacentes o recrutamento ao complexo do alongamento e regulação das enzimas responsáveis pelo nivelamento, splicing e poliadenilação cotranscricional.
Não surpreendentemente, o desenvolvimento de tais sistemas experimentais tem sido difícil. Um grande impedimento tem sido a notável complexidade da própria transcrição de pol II, onde simplesmente reconstituir a transcrição basal por pol II in vitro requer um conjunto mínimo de cinco fatores gerais de iniciação de transcrição: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF e TFIIH 1. Além disso, reconstituindo qualquer tipo de pol II regulamentada transcrição in vitro requer um conjunto ainda maior de fatores de transcrição e coregulators. Assim, um objetivo principal foi desenvolver sistemas experimentais mais simples que permitam a reconstituição de complexos de alongamento ativos de pol II adequados para investigações do acoplamento funcional da transcrição de pol II e do processamento de RNA.
Um método mais simples para a reconstituição de complexos de alongamento ativos de pol II provou ser útil para estudos estruturais e bioquímicos de alongamento pol II e, mais recentemente, para investigar o processamento de RNA co-transcricional2,3 ,4,5. Neste artigo, nós mostramos como os complexos do alongamento de pol II preparados das bolhas purificadas de pol II e de transcrição sintética podem ser usados eficazmente para investigar os mecanismos que subjacentes o nivelamento co-transcriptional de transcritos nascente de pol II.
Tampando refere-se à adição covalente de um 5 ‘-guanosina “tampão” para o 5 ‘-trifosfato final de nascente pol II transcrições. A PAC é importante para etapas subsequentes da maturação do mRNA, transporte, tradução e outros processos6,7. O tampão é adicionado co-transcripcionalmente aos transcritos de pol II por uma enzima referida como a enzima tampando. Em células de mamíferos, locais ativos responsáveis pelas atividades de RNA 5 ‘-trifosfatase e guanil transferase da enzima tampando estão contidos em um único polipeptídeo8. A enzima tampando é recrutada para o complexo de alongamento de pol II através de interações com superfícies ainda definidas no corpo de pol II e o domínio Rpb1 carboxy-terminal (CTD) fosforilado em Ser5 de suas repetições de heptapeptídeo5. No complexo do alongamento, a enzima tampando catalisa a adição de um tampão de 5 ‘-guanosine uma vez que o transcrito nascente alcança um comprimento de pelo menos 18 nucleotídeos e emergiu do canal da saída do RNA do polymerase. Na primeira etapa da reação tampando, o triphosphatase hidrolisa o RNA 5 ‘-triphosphate para render um 5 ‘-diphosphate. Na segunda etapa, o GTP é hidrolisado para GMP pelo guanil transferase, formando um intermediário de enzima GMP-tampando. Finalmente, o transferase do guanil transfere o PBF à extremidade 5 ‘-diphosphate do transcrito nascente para produzir a tampa.
Uma característica notável da reação tampando é que o nivelamento co-transcriptional (isto é, tampando dos transcritos associados com os complexos funcionais do alongamento de pol II) é muito mais eficiente do que tampando do RNA livre5,9. Assim, uma grande questão no campo tem sido como esta ativação dramática de nivelamento é alcançada através de interações da enzima tampando com o complexo de alongamento pol II. Neste protocolo nós descrevemos o conjunto de complexos ativos do alongamento do polymerase II do RNA que usam somente o polymerase purificado II do RNA e bolhas artificiais da transcrição. Estes métodos permitem a criação de complexos de alongamento de RNA polimerase II com transcrições de comprimento e seqüência definidos. Em um estudo recente, utilizamos estes complexos de alongamento de RNA polimerase II definidos como um modelo para investigar aspectos dos mecanismos do RNA tampando5. Em particular, nós mostramos que (i) o nivelamento do RNA associado com estes complexos do alongamento era mais do que 100-fold mais eficiente do que tampando do RNA livre e (II) foi estimulado pela fosforilação TFIIH-dependente do pol II CTD. A abordagem aqui descrita poderia, em princípio, ser adaptada para gerar substratos para o estudo de outras reações de processamento de RNA cotranscricional ligadas ao complexo de alongamento pol II.
Na seção 1 deste protocolo, os complexos artificiais do alongamento são criados recozimento um oligonucleotide sintético da vertente do ADN do molde a um oligonucleotide do RNA que seja complementar em seus 3 ‘-extremidade a aproximadamente 9 nucleotídeos do ADN da costa do molde. Pol II é então carregado no DNA: RNA duplex. O complexo do alongamento é terminado então pela adição de um oligonucleotide parcialmente complementar, do ADN da vertente do não-molde que seja etiquetado com a biotina em seus 3 ‘-extremidade (Figura 1 e Figura 2a). O oligonucleotide do RNA é estendido por pol II nestes complexos do alongamento para fazer transcritos radiolabeled do comprimento e da seqüência definidos em cima da adição de combinações apropriadas de nucleotides radiolabeled. Além disso, usando uma combinação de lavagens para remover nucleotídeos não incorporados e adição adicional de diferentes combinações de nucleotídeos, pode-se “andar” pol II para diferentes posições ao longo do modelo de DNA e sintetizar RNA de comprimentos definidos. O RNA é então purificado e submetido à eletroforese em géis de desnaturação da ureia. Na seção 2 do protocolo, complexos de alongamento artificial são usados para analisar a tampagem de RNA cotranscricional. O exemplo apresentado mede o efeito da fosforilação TFIIH-dependente do pol II CTD sobre a tampagem de RNA cotranscricional. Neste experimento, medimos a extensão do nivelamento cotranscricional em função da concentração da enzima tampando (5, 15 e 45 ng por reação) e tempo (1, 2 e 4 min).
Protocol
Representative Results
Discussion
Os estudos que procuram dissecar eventos acoplados ao complexo do alongamento de pol II tais como o processamento do RNA e a regulação do alongamento do transcrito próprio podem extremamente ser facilitados pelo uso de um sistema altamente purified da enzima. A criação de tais sistemas enzimáticos pode ser desafiador. A transcrição dependente do promotor por pol II requer pelo menos cinco fatores gerais de transcrição. Preparar e estocar esses fatores pode levar meses; Portanto, a etapa limitante deste processo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a S. Shuman por fornecer a enzima tampando de mamíferos cDNA. Este trabalho foi apoiado em parte por uma subvenção para o Instituto de pesquisa médica de Stowers do fundo de pesquisa médica de Helen Nelson na fundação da Comunidade da grande Kansas City. Os dados originais subjacentes a este manuscrito podem ser acessados a partir do repositório de dados original do Stowers em http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
