Vurdering af Zebrafish linse kerne lokalisering og Sutural integritet

Summary

Disse protokoller blev udviklet til at analysere kortikale linse morfologi, strukturel integritet af: zebrafisk linse suturer i faste og levende linser og til at målepositionen af zebrafisklinsen kerne langs den forreste-posteriore akse.

Abstract

Den zebrafisk er unikt egnet til genetisk manipulation og in vivo Imaging, hvilket gør det til en stadig mere populær model for reverse genetiske undersøgelser og for generation af transgenics for in vivo Imaging. Disse unikke kapaciteter gør Zebrafisken til en ideel platform til at studere okulær linse udvikling og fysiologi. Vores nylige fund, at en aquaporin-0, Aqp0a, er nødvendig for stabiliteten af den forreste linse sutur, samt for skiftet af linsen kerne til linsen Center med alderen førte os til at udvikle værktøjer specielt velegnet til at analysere egenskaberne af: zebrafisk linser. Her skitserer vi detaljerede metoder til linse dissektion, der kan anvendes til både larve og voksne linser, til at forberede dem til histologisk analyse, immunhistokemi og billeddannelse. Vi fokuserer på analyse af linse sutur integritet og kortikale celle morfologi og sammenligne data genereret fra dissekerede linser med data fra in vivo billedbehandling af linse morfologi muliggjort af en roman transgene: zebrafisk linje med en genetisk kodede fluorescerende markør. Analyse af dissekerede linser vinkelret på deres optiske akse gør det muligt at kvantificere den relative position af linse kernen langs den forreste-posteriore akse. Bevægelse af linse kernen fra en indledende forreste position til centrum er nødvendig for normal linse optik i voksne zebrafisk. Således en kvantitativ måling af linsen nukleare position direkte korrelerer med sine optiske egenskaber.

Introduction

Den: zebrafisk er en glimrende model for at studere linse udvikling og fysiologi på grund af de anatomiske ligheder med pattedyrs linser, relativ lethed af genetiske og farmakologiske manipulation, hastighed af embryonale øjen udvikling, lille størrelse og gennemsigtighed tidligt stadie, hvilket muliggør in vivo -billeddiagnostik. De metoder, der er beskrevet her blev udviklet til at analysere: zebrafisk linse morfologi på embryonale og voksne stadier med fokus på den suturmæssige integritet, kortikale membran morfologi in vitro og in vivo, og placeringen af linsen nukleare position langs forreste-posteriort akse ex vivo. Disse metoder tjener som udgangspunkt for funktionelle undersøgelser af linse udvikling og fysiologi, samt omvendte genetiske skærme til linse fænotyper i zebrafish.

Billeddannende zebrafisklinse morfologi

Aquaporin 0 (AQP0) er den mest rigelige linse membran protein og er afgørende for både linse udvikling og klarhed, på grund af flere væsentlige funktioner i pattedyr. Zebrafish har to Aqp0s (Aqp0a og Aqp0b), og vi har udviklet metoder til at analysere tabet af deres funktioner i både embryonale og voksne linser. Vores undersøgelser afslører, at^aqp0a-/-mutanter udvikler forreste polær uigennemsigtighed på grund af ustabilitet i den forreste sutur, og aqp0a/b dobbelt mutanter udvikler nuklear opacitet¹. AQP0 har vist sig at spille roller i vand transport², vedhæftning^3,4, cytoskeletale forankring⁵ og generering af brydningsindeks gradient⁶, men disse undersøgelser er stort set blevet udført i vitro-diagnostik. Den: zebrafisk giver en unik mulighed for at studere, hvordan tab af funktion, eller forstyrres funktion af Aqp0a eller Aqp0b ville påvirke morfologi og funktion i en levende linse. For at vurdere cellernes morfologi og den kulturelle integritet under udviklingen ændrede vi eksisterende in vitro immunohistokemiske metoder⁷ til brug i embryonale og voksne linser og genererede transgenics til at overvåge denne proces in vivo .

Immunohistokemisk analyse af plasma membran struktur og den suturmæssige integritet blev udført i hele faste embryoner og voksne linser. Zebrafish linser er ekstremt små (linse diameter er ~ 100 μm i embryoner og op til 1 mm hos voksne) sammenlignet med deres pattedyr-modparter og har punkt suturer⁸, som sjældent fanges i kryosektioner. Således hele linser er afgørende for at analysere den kulturelle integritet. Til in vivo analyse af forreste sutur dannelse, og billeddannelse af præcis linse celle arkitektur, genererede vi transgenics udtrykker Mapple specifikt mærkning linse membraner.

Fordele ved levende billeddannelse af linse membran transgenics omfatter: 1) undgå fiksering artefakter, 2) studere dynamiske morfologiske ændringer i time-lapse film, og 3) muliggør langsgående undersøgelser, hvor tidligere begivenheder kan korreleres med senere Fænotyper. Pigmentering af iris forhindrer normalt klar billeddannelse af objektivets periferi. Tilsætning af 1-phenyl 2-thiourea (PTU) før primordia-5 (Prim-5) stadie⁹ forhindrer melanogenese og øjen pigmentering op til omkring 4 dage efter befrugtning (DPF). Efter 4 DPF skjules objektivets periferi dog in vivo, især i ældre stadier. Endvidere, tætheden af linsen selv tilslører billeddannelse af sin posterior stang. Derfor, for at studere morfologi af linsen periferi, eller posterior sutur, efter 4 DPF, linser skal være fjernet og fast.

Transgene: zebrafisk linjer er blevet anvendt til at analysere embryonale linse membran struktur i vivo¹⁰. Q01 transgene udtrykker et cyan fluorescerende protein, der er smeltet til en membran målretnings sekvens, Gap43, drevet af EF1α promoter og en hexamer af DF4 PAX6 forstærker-elementet allestedsnærværende i linse fiber celler¹¹. Q01 har ekstra-lenkulære udtryk, herunder amacrine celler i nethinden, som tilføjer baggrunds signal, hvis den primære interesse er linsen. Vi udviklede en roman transgene linje, der udtrykker en membran-tøjret mApple specifikt i linsen, med det formål at undgå enhver ekstra-linse-signal.

Lokalisering af linse kerne

Vi opdagede, at linse kernen bevæger sig fra en indledende forreste placering i larve: zebrafisk til en central placering i den forreste-posterior akse i voksne linser. Dette skift i positionen af den høje brydningsindeks linse kerne menes at være et krav til normal udvikling af: zebrafisk linse optik¹. Vores metoder muliggør kvantificering af objektivets nukleare centralisering i forhold til linse radius. Ved hjælp af denne metode, vi viste, at Aqp0a er nødvendig for linse nuklear centralisering¹, og denne enkle metode kan anvendes til andre undersøgelser af udviklingen og fysiologi af linsen og dens optiske egenskaber i: zebrafisk model.

Protocol

De dyre protokoller, der anvendes i denne undersøgelse, overholder ARVO-erklæringen om brug af dyr i oftalmisk forskning og Synsundersøgelse og er blevet godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) fra University of California, Irvine. 1. opdræt af zebrafish og eutanasi Hæv og vedligehold zebrafisk (AB stamme) under standard laboratoriebetingelser12. Fostre embryoner i embryonale medium (EM)12. Ti…

Representative Results

Voksne: zebrafisk øjen anatomi ligner nøje pattedyr (figur 1a). På trods af nogle forskelle mellem zebrafisk og pattedyr øjne, såsom at have en ciliære zone i stedet for en ciliære krop17, forskelle i optiske egenskaber18, og forskelle i morfogenese under fosterudvikling19, den : zebrafisk Eye er en glimrende model til at studere øjen udvikling og forståelse oftalmologiske sygdom…

Discussion

Analyse af: zebrafisk linse morfologi er det første skridt til at forstå fænotyper i mutanter, eller virkningerne af farmakologiske interventioner rettet mod at studere biologi af okulær linse. Vi skitserer metoder til at analysere linse suturer, kortikale fiber celle morfologi og aspekter af linsen kerne. Disse tilgange er en kombination af in vitro og in vivo (sammenlignet i tabel 1). In vitro metoderne giver mulighed for større detaljering af den ydre kortikale cellers …

Materials

1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629	CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	RT 157-4	CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope	Nikon	Eclipse Ti-E
Cryostat	Leica	CM3050S	Objective and chamber temperature set to -21˚C
DAPI	Invitrogen	D1306	CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128	CAUTION – combustible, penetrates skin
Disposable base mold	VWR Scientific	15154-631
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A
Dumont # 5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040	CAUTION – toxic
Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Glycerol	Sigma	G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct	Addgene	ID:122451
ImageJ	Wayne Rasband, NIH	v1.51n
Low Melt Agarose (LMA)	Apex	902-36-6
NIS-Elements	Nikon	V 4.5
NIS-Elements AR software	Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller	Olympus Corp	DP70
Olympus microscope	Olympus Corp	SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546	Thermo Fisher	A22283
Phenol Red indicator (1% w/v)	Ricca Chemical Company	5725-16
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Photoshop	Adobe	CS5 v12.0
Photoshop software	Adobe	CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective	Nikon
Power source	Wild Heerbrugg	MTr 22	Or equivalent power source
Slide warmer model No. 26020FS	Fisher Scientific	12-594
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide	Fisher Scientific	12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning	World Prevision Instruments	SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583
Triton X-100 BioXtra	Sigma	T9284	CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium	Vector laboratories	H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594	Life Technologies	W11262