הערכה של השפות הגרעין של העדשה Zebrafish ושלמות הsutural
Summary
פרוטוקולים אלה פותחו כדי לנתח מורפולוגיה עדשה קורטיקלית, שלמות מבנית של התפרים העדשה דג זברה בעדשות קבועות וחיות למדוד את המיקום של גרעין העדשה דג זברה לאורך הציר האחורי הקדמי.
Abstract
דג דג זברה מתאים באופן ייחודי מניפולציה גנטית vivo הדמיה, מה שהופך אותו מודל פופולרי יותר ויותר עבור מחקרים גנטיים הפוכה ועבור דור של transgenics עבור הדמיה vivo . אלה יכולות ייחודי להפוך את דג זברה פלטפורמה אידיאלית כדי ללמוד התפתחות עדשה עינית ופיזיולוגיה. הממצאים האחרונים שלנו כי aquפורטל in-0, Aqp0a, נדרש עבור היציבות של תפר העדשה הקדמית, כמו גם עבור שינוי של גרעין העדשה אל מרכז העדשה עם הגיל הובילו אותנו לפתח כלים במיוחד מתאים לנתח את המאפיינים של עדשות דג זברה. כאן אנו מתווה שיטות מפורטות לניתוח עדשות שניתן להחיל הן על הזחל והן עדשות למבוגרים, כדי להכין אותם ניתוח היסטולוגית, אימונוהיסטוכימיה והדמיה. אנו מתמקדים בניתוח של שלמות תפר עדשה ומורפולוגיה תא קורטיקלית ולהשוות נתונים שנוצרו מעדשות גזור עם נתונים שהתקבלו מתוך vivo הדמיה של מורפולוגיה עדשה האפשרי על ידי קו מגנטי הרומן הטרנסגניים עם מגנטית סמן פלורסנט מקודד. ניתוח לגזור עדשות בניצב הציר האופטי שלהם מאפשר כימות של המיקום היחסי של גרעין העדשה לאורך הציר הקדמי האחורי. התנועה של הגרעין העדשה מעמדה קדמית ראשונית למרכז נדרש עבור עדשה רגילה אופטיקה בוגרים zebrafish. כך, מידה כמותית של העמדה הגרעינית עדשה במישרין ישירות עם תכונות אופטיות שלה.
Introduction
דג דג זברה הוא מודל מעולה ללמוד פיתוח עדשות ופיזיולוגיה בשל הדמיון האנטומי לעדשות היונקים, קלות יחסית של מניפולציה גנטית ופרמקולוגית, מהירות של פיתוח עיניים עובריים, גודל קטן ושקיפות בשלבים המוקדמים המאפשרים הדמיה vivo . השיטות המתוארות כאן פותחו כדי לנתח את מורפולוגיה עדשה של דג דג זברה ב שלבים עובריים ומבוגרים עם דגש על שלמות sutural מורפולוגיה קרום הקליפת בתוך מבחנה ב vivo, ומיקום של מיקום העדשה גרעינית לאורך ה הצירים האחוריים לשעבר vivo. שיטות אלה משמשות כנקודת התחלה עבור מחקרים פונקציונליים של פיתוח עדשות ופיזיולוגיה, כמו גם מסכי גנטי הפוכה עבור פנוטיפים עדשה ב-zebrafish.
דימות מורפולוגיה של עדשות ההדמיה
אקופורטל 0 (AQP0) הוא חלבון ממברנה שופע ביותר העדשה הוא קריטי עבור הן, פיתוח עדשה ובהירות, בשל פונקציות חיוניות מרובות יונקים. Zebrafish יש שני Aqp0s (Aqp0a ו Aqp0b) ואנחנו פיתחנו שיטות לנתח את האובדן של הפונקציות שלהם בעדשות עובריים ולמבוגרים. מחקרים שלנו לגלות כי aqp0a-/-מוטציות לפתח אטימות הקוטב הקדמי עקב חוסר יציבות של תפר קדמי, ו aqp0a/b מוטציות כפולות לפתח אטימות גרעינית1. AQP0 הוכח לשחק תפקידים בתחבורה מים2, הדבקה3,4, השלד הציטומי עיגון5 והדור של מדד השבירה הדרגתי6, אבל מחקרים אלה בוצעו בעיקר ב . בעלי מבחנה דג דג זברה מספק הזדמנות ייחודית ללמוד כיצד אובדן פונקציה, או פונקציה מודאג של Aqp0a או Aqp0b ישפיע על מורפולוגיה ותפקוד בעדשה חיה. כדי להעריך מורפולוגיה של תא עדשה ושלמות sutural במהלך הפיתוח, אנו שונו הקיים שיטות מחוץ לתחום האימונוהיסטוכימיה7 לשימוש בעדשות עובריים ומבוגרים, ו transgenics שנוצר כדי לפקח על תהליך זה vivo .
אימונוהיסטוכימיה ניתוח של מבנה קרום הפלזמה ויושר שלמות התבצע בעוברים קבועים שלמים ועדשות מבוגרים. עדשות zebrafish הם קטנים מאוד (קוטר העדשה הוא ~ 100 יקרומטר בעוברים ועד 1 מ”מ בקרב מבוגרים) לעומת עמיתיהם היונקים שלהם יש תפר נקודה8, אשר נלכדו לעתים רחוקות ב קריודורים. לכן, עדשות שלמות חיוניים לניתוח שלמות. עבור בניתוח vivo של היווצרות תפר הקדמי, והדמיה של אדריכלות תא עדשה מדויקת, יצרנו transgenics המבטא mapple תיוג במיוחד ממברנות עדשה.
היתרונות של הדמיה חיה של העדשה ממברנה transgenics כוללים: 1) הימנעות ממצאים קיבעון, 2) לימוד שינויים דינמיים מורפולוגית בסרטים הזמן פקיעה, ו 3) המאפשר מחקרים האורך שבו ניתן לתאם אירועים מוקדמים יותר פנוטיפים. פיגמנטציה של הקשתית בדרך כלל מונע הדמיה ברורה של הפריפריה העדשה. תוספת של 1-פניקסיל 2-thiourea (PTU) לפני הפרידייה-5 (פרים-5) שלב9 מונע מלאנוגנזה ועין פיגמנטציה עד סביב 4 ימים הפריה (dpf). עם זאת, לאחר 4 dpf, הפריפריה העדשה מטושטשת בvivo, במיוחד בשלבים הישנים. יתר על כן, הצפיפות של העדשה עצמה מטשטש הדמיה של הקוטב האחורי שלה. לכן, כדי ללמוד מורפולוגיה של הפריפריה העדשה, או את התפר האחורי, לאחר 4 dpf, עדשות צריך להיות מסודר וקבוע.
שורות הטרנסגניים משמשות לניתוח מבנה קרום העדשה העובריים ב vivo10. Q01 טרנסגניים מבטאת חלבון פלורסנט ציאן התמזגו לרצף המיקוד של קרום, Gap43, מונע על ידי היזם EF1α והוא הרכיב של האלמנט DF4 pax6 שיפור אוביסקוטיות בתאי סיבים העדשה11. Q01 יש ביטוי אקסטרה מולקולרית, כולל תאים אמקרין ברשתית, אשר מוסיף אות ברקע אם העניין העיקרי הוא העדשה. פיתחנו קו טרנסגניים הרומן המבטא ממברנה קשור ממברנות במיוחד בעדשה, עם המטרה של הימנעות כל האות הנוספת העדשה.
לוקליזציה של גרעין העדשה
גילינו כי גרעין העדשה נע ממיקום הקדמי הראשוני בזחל הדגים למיקום מרכזי בציר הקדמי-אחורי של עדשות למבוגרים. זה משמרת במיקום של השבירה הגבוהה מדד העדשה הגרעין הוא חשב להיות דרישה להתפתחות נורמלית של עדשת העדשה של דג זברה1. השיטות שלנו מאפשרות לכמת את העדשה של צנטליזציה גרעינית ביחס לרדיוס העדשה. באמצעות שיטה זו, הראנו כי Aqp0a נדרש עבור העדשה ריכוז גרעיני1, ושיטה זו פשוטה ניתן להחיל על מחקרים אחרים של פיתוח ופיזיולוגיה של העדשה התכונות האופטיות שלה במודל דג זברה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח של מורפולוגיה עדשה דג זברה הוא הצעד הראשון הבנת פנוטיפים המוטציות, או את ההשפעות של התערבויות תרופתי מכוון ללמוד ביולוגיה של העדשה העינית. אנו מתווה שיטות לניתוח תפרים עדשה, מורפולוגיה תא הקליפת סיבים והיבטים של גרעין העדשה. גישות אלה הן שילוב של מבחנה ב – vivo (בהשוואה לט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
היינו רוצים להכיר את מקור המימון שלנו: NIH R01 EY05661 ל-J. E. H, Ines Gehring לסיוע ביצירת המוטנטים aqp0a/b כפול וגידול בדגים, ד ר דניאל נדרנוב לדיונים המובילים ליצירת הטרנסגנאנים, ד ר ברוס בלומברג ומעבדות ד ר קן צ’ו לשימוש הניתוח שלהם מיקרוסקופ, ד ר מייגן סמית לעזרה עם אנליזה סטטיסטית.
Materials
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21˚C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont # 5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION – toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
References
- Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
- Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
- Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
- Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
- Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
- Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).
- Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. 261, 59-94 (2002).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
- Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
- Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
- Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
- Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
- Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
- Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
- Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
- Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
- Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
- Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
- Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
