Valutazione del nucleo di lenti zebrafish localizzazione e integrità suturale
Summary
Questi protocolli sono stati sviluppati per analizzare la morfologia delle lenti corticali, l’integrità strutturale delle suture delle lenti pesce zebra in lenti fisse e Live e per misurare la posizione del nucleo della lente pesce zebra lungo l’asse anteriore-posteriore.
Abstract
Il pesce zebra è particolarmente adatto alla manipolazione genetica e all’imaging in vivo , rendendolo un modello sempre più diffuso per gli studi genetici inversi e per la generazione di transgeniche per l’imaging in vivo . Queste capacità uniche rendono il pesce zebra una piattaforma ideale per studiare lo sviluppo e la fisiologia delle lenti oculari. I nostri recenti risultati che un aquaporin-0, Aqp0a, è necessario per la stabilità della sutura dell’obiettivo anteriore, così come per lo spostamento del nucleo della lente al centro dell’obiettivo con l’età ci ha portato a sviluppare strumenti particolarmente adatti ad analizzare le proprietà delle lenti pesce zebra. Qui delineamo metodi dettagliati per la dissezione delle lenti che possono essere applicate sia alle lenti larvale che agli adulti, per prepararle per l’analisi istologica, l’immunoistochimica e l’imaging. Ci concentriamo sull’analisi dell’integrità della sutura dell’obiettivo e della morfologia delle cellule corticali e confrontiamo i dati generati dalle lenti dissezionate con i dati ottenuti dall’imaging in vivo della morfologia delle lenti resa possibile da una nuova linea di pesce zebra transgenica con un geneticamente marcatore fluorescente codificato. L’analisi delle lenti dissezionate perpendicolari al loro asse ottico consente di quantificare la posizione relativa del nucleo dell’obiettivo lungo l’asse anteriore-posteriore. Il movimento del nucleo dell’obiettivo da una posizione anteriore iniziale al centro è necessario per le ottiche lente normali nel pesce zebra adulto. Pertanto, una misura quantitativa della posizione nucleare dell’obiettivo è direttamente correlata alle sue proprietà ottiche.
Introduction
Il pesce zebra è un ottimo modello per studiare lo sviluppo e la fisiologia delle lenti a causa delle somiglianze anatomiche con le lenti dei mammiferi, la relativa facilità di manipolazione genetica e farmacologica, la velocità di sviluppo embrionale degli occhi, le piccole dimensioni e la trasparenza fasi iniziali che consentono l’imaging in vivo . I metodi qui descritti sono stati sviluppati per analizzare la morfologia delle lenti pesce zebra a stadi embrionali e adulti con particolare attenzione all’integrità suturale, alla morfologia della membrana corticale in vitro e in vivoe alla posizione della posizione nucleare dell’obiettivo lungo la asse anteriore-posteriore ex vivo. Questi metodi fungono da punto di partenza per gli studi funzionali sullo sviluppo e la fisiologia delle lenti, nonché sugli schermi genetici inversi per i fenotipi delle lenti nel pesce zebra.
Imaging morfologia delle lenti pesce zebra
Aquaporin 0 (AQP0) è la proteina di membrana della lente più abbondante ed è fondamentale per entrambi, lo sviluppo della lente e la chiarezza, a causa di molteplici funzioni essenziali nei mammiferi. I zebrafish hanno due Aqp0s (Aqp0a e Aqp0b) e abbiamo sviluppato metodi per analizzare la perdita delle loro funzioni sia nelle lenti embrionali che in quelle adulte. I nostri studi rivelano cheaqp0a-/-mutanti sviluppano opacità polare anteriore a causa dell’instabilità della sutura anteriore, e aqp0a/b doppi mutanti sviluppano opacità nucleare1. AQP0 ha dimostrato di svolgere ruoli nel trasporto dell’acqua2, adesione3,4, citoscheletro ancoraggio5 e generazione del gradiente indice di rifrazione6, ma questi studi sono stati in gran parte eseguiti in in vitro. Il pesce zebra fornisce un’opportunità unica per studiare come la perdita di funzione o la funzione perturbata di Aqp0a o Aqp0b influenzerebbero la morfologia e la funzione in una lente vivente. Per valutare la morfologia delle cellule lente e l’integrità suturale durante lo sviluppo, abbiamo modificato i metodi immunoistochimici esistenti in vitro 7 per l’uso in lenti embrionali e adulte, e hanno generato transgenici per monitorare questo processo in vivo .
L’analisi immunoistochimica della struttura della membrana plasmatica e dell’integrità suturale è stata eseguita in embrioni fissi interi e lenti per adulti. Le lenti zebrafish sono estremamente piccole (il diametro della lente è ~ 100 μm in embrioni e fino a 1 mm negli adulti) rispetto ai loro omologhi di mammiferi e hanno punti di sutura8, che sono raramente catturati in criosezioni. Pertanto, le lenti intere sono essenziali per l’analisi dell’integrità suturale. Per l’analisi in vivo della formazione di sutura anteriore e per l’imaging di un’architettura delle cellule lente precisa, abbiamo generato delle transgeniche che esprimono Mapple etichettando specificatamente le membrane delle lenti.
I vantaggi dell’Imaging Live della membrana transgenica delle lenti includono: 1) evitando artefatti di fissazione, 2) studiando cambiamenti morfologici dinamici nei film time-lapse e 3) consentendo studi longitudinali in cui gli eventi precedenti possono essere correlati con i successivi Fenotipi. La pigmentazione dell’iride normalmente previene la chiara Imaging della periferia dell’obiettivo. L’aggiunta di 1-phenyl 2-Thiourea (PTU) prima della Primordia-5 (prim-5) fase9 previene la melanogenesi e la pigmentazione oculare fino a circa 4 giorni dopo la fertilizzazione (DPF). Tuttavia, dopo 4 DPF, la periferia dell’obiettivo è oscurata in vivo, in particolare nelle fasi più vecchie. Inoltre, la densità della lente stessa oscura l’imaging del suo palo posteriore. Pertanto, per studiare la morfologia della periferia della lente, o la sutura posteriore, dopo 4 DPF, le lenti devono essere asportate e fissate.
Le linee pesce zebra transgeniche sono state utilizzate per analizzare la struttura della membrana embrionale della lente in vivo10. L’ Q01 transgenici esprime una proteina ciano fluorescente fusa ad una sequenza di targeting per membrana, Gap43, guidata dal promotore EF1α e un ESAMER dell’elemento DF4 PAX6 Enhancer onnipresente nelle cellule della fibra ottica11. Q01 ha un’espressione extra-lenticolare, comprese le cellule amacrine nella retina, che aggiunge il segnale di fondo se l’interesse primario è l’obiettivo. Abbiamo sviluppato una nuova linea transgenica che esprime un mApple legato a membrana specificamente nella lente, con l’obiettivo di evitare qualsiasi segnale extra-lenticolare.
Localizzazione del nucleo dell’obiettivo
Abbiamo scoperto che il nucleo della lente si muove da una posizione anteriore iniziale nel pesce zebra larvale in una posizione centrale nell’asse anteriore-posteriore nelle lenti adulte. Questo cambiamento nella posizione del nucleo dell’obiettivo ad alto indice di rifrazione è pensato per essere un requisito per lo sviluppo normale dell’ottica delle lenti pesce zebra1. I nostri metodi consentono la quantificazione della centralizzazione nucleare dell’obiettivo in relazione al raggio della lente. Utilizzando questo metodo, abbiamo mostrato che Aqp0a è necessario per la centralizzazione nucleare dell’obiettivo1, e questo metodo semplice può essere applicato ad altri studi dello sviluppo e della fisiologia della lente e delle sue proprietà ottiche nel modello pesce zebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analisi della morfologia delle lenti pesce zebra è il primo passo nella comprensione dei fenotipi nei mutanti, o degli effetti degli interventi farmacologici finalizzati allo studio della biologia della lente oculare. Delineamo metodi per analizzare le suture lente, la morfologia delle cellule della fibra corticale e gli aspetti del nucleo della lente. Questi approcci sono una combinazione di in vitro e in vivo (rispetto alla tabella 1). I metodi in vitro consentono un maggi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere la nostra fonte di finanziamento: NIH R01 EY05661 a J. E. H, Ines Gehring per aver assistito alla generazione del aqp0a/b doppio mutanti e allevamento di pesce zebra, Dr Daniel dranow per le discussioni che portano alla generazione dei transgenici, il dottor Bruce I laboratori di Blumberg e Dr Ken Cho per l’uso dei loro microscopi dissezione, e il dottor Megan Smith per l’aiuto con l’analisi statistica.
Materials
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21˚C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont # 5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION – toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
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