Zebrafish objektif Nucleus yerelleştirme ve sütür bütünlüğü değerlendirmesi
Summary
Bu protokoller kortikal lens morfolojisi, sabit ve canlı lenslerde zebra balığı lens sütürler yapısal bütünlüğü analiz etmek ve anterior-posterior eksen boyunca zebra balığı lens çekirdeğinin konumunu ölçmek için geliştirilmiştir.
Abstract
Zebra balığı, genetik manipülasyon ve In vivo görüntüleme için benzersiz bir şekilde uygundur ve bu da ters genetik çalışmalar için ve in vivo görüntüleme için transgenics üretimi için giderek daha popüler bir model haline gelmiştir. Bu benzersiz yetenekleri zebra balığı oküler lens geliştirme ve Fizyoloji çalışma için ideal bir platform olun. Son bulgularımız bir Aquaporin-0, Aqp0a, anterior objektif sütür istikrar için gerekli olduğunu, hem de yaş ile objektif merkezi objektif çekirdeğinin kayması için bize özellikle zebra balığı lensler özelliklerini analiz etmek için uygun araçları geliştirmeye yol açtı. Burada hem larva hem de yetişkin lensler için uygulanabilir objektif diseksiyon için ayrıntılı Yöntemler özetlemektedir, histolojik analiz, immünhistokimya ve görüntüleme için hazırlamak. Objektif sütür bütünlüğü ve kortikal hücre morfolojisi analizine odaklanıyoruz ve objektif morfolojisinin In vivo görüntülemesinde elde edilen verilerle disseke lenslerden üretilen verileri, genetik olarak bir yeni transgenik zebra balığı hattı ile mümkün hale kodlanmış floresan Marker. Optik eksenine dik olan disseke lenslerin analizi, objektif çekirdeğinin anterior-posterior eksen boyunca göreli konumunun ölçülmesini sağlar. Bir ilk anterior konumdan merkeze objektif çekirdeğinin hareketi yetişkin zebrafish normal lens optik için gereklidir. Böylece, objektif nükleer pozisyon nicel bir ölçü doğrudan optik özellikleri ile ilişkilidir.
Introduction
Zebra balığı, memeliler lenslere anatomik benzerlik, genetik ve farmakolojik manipülasyon, embriyonik göz gelişimi hızı, küçük boyut ve şeffaflık nedeniyle objektif gelişimi ve fizyolojisinin incelenmesi için mükemmel bir modeldir. In vivo görüntüleme için izin erken aşamalarında. Burada açıklanan yöntemler, sütür bütünlüğü, kortikal membran morfoloji in vitro ve in vivove objektif nükleer pozisyonun konumu ile birlikte embriyonik ve yetişkin aşamalarında zebra balığı lens morfolojisi analiz etmek için geliştirilmiştir. anterior-posterior eksen ex vivo. Bu yöntemler, objektif gelişimi ve fizyolojisinin fonksiyonel çalışmaları için bir başlangıç noktası olarak ve zebrafish objektif fenotürleri için ters genetik ekranlar olarak hizmet vermektedir.
Görüntüleme zebra balığı objektif morfoloji
Aquaporin 0 (AQP0) en bol objektif membran proteindir ve memelilerde birden çok temel fonksiyon nedeniyle, objektif gelişimi ve netlik için kritik öneme sahiptir. Zebrafish iki Aqp0s (Aqp0a ve Aqp0b) ve biz hem embriyonik ve yetişkin lensler fonksiyonlarının kaybını analiz etmek için yöntemler geliştirdik. Çalışmalarımız, aqp0a-/-mutantların anterior sütür istikrarsızlığından dolayı anterior kutup opaklığı geliştirmesini ve aqp0a/b çift mutantların nükleer opaklık geliştirilmesi olduğunu ortaya koyuyor1. AQP0 su taşımacılığı2, yapışma3,4, sitorsel çapa5 ve Refraktif endeks gradyan6nesil roller oynamak için gösterilmiştir, ancak bu çalışmalar büyük ölçüde yapılmıştır vitro. Zebra balığı, fonksiyon kaybına veya Aqp0a veya Aqp0b ‘in tedirgin fonksiyonunun yaşam merceğinin morfolojisi ve fonksiyonunu nasıl etkileyeceğini incelemek için benzersiz bir fırsat sağlar. Gelişme sırasında objektif hücre morfolojisi ve sümetik bütünlüğünü değerlendirmek için, embriyonik ve yetişkin lenslerde kullanılmak üzere mevcut in vitro immünohistokimyasal yöntemleri7 ‘ ye değiştirdik ve bu süreci izlemek için üretilen transgenikler içinde vivo .
Tüm sabit embriyolar ve yetişkin lenslerde plazma membranı yapısı ve sütür bütünlüğü immunhistokimyasal analizi yapıldı. Zebrafish lensleri son derece küçüktür (objektif çapı, embriyolarda ~ 100 μm ve yetişkinlerde 1 mm ‘ye kadar), memeli meslektaşları ile karşılaştırıldığında Böylece, tüm lensler dikiş bütünlüğü analiz etmek için gereklidir. Ön sütür oluşumunun In vivo Analizi ve hassas objektif hücre mimarisinin görüntülenmesi Için, Mapple ‘ı özellikle objektif membranlarının etiketlemesi konusunda ifade eden transgenikler ürettik.
Objektif membran transgeniklerin canlı görüntülemenin avantajları şunlardır: 1) zaman atlamalı filmlerde dinamik morfolojik değişiklikleri okuyan, 2) sabitleme eserler kaçınarak, ve 3) daha önceki olayların daha sonra korelasyon olabilir uzunlamasına çalışmalar sağlayan fenotipleri. İris pigmentasyon normalde objektif çevre net görüntüleme önler. Primordia-5 (prim-5) aşamasından önce 1-fenil 2-Thiourea (PTU) eklenmesi, melanogenesis ve göz pigmentasyonunu yaklaşık 4 gün postfertilizasyon (DPF) olarak önler. Ancak 4 DPF ‘den sonra lens çevresi özellikle eski aşamalarda in vivoolarak gizlenir. Ayrıca, objektifin yoğunluğu kendisi arka kutup görüntüleme gizler. Bu nedenle, lens çevre veya posterior sütür morfoloji çalışma, 4 DPF sonra, lensler eksize ve sabit olması gerekir.
Zojenik zebrafit hatları , vivo 10 ‘ daembriyonik objektif membran yapısını analiz etmek için kullanılmıştır. Q01 transjenik bir membran hedefleme dizisi için erimiş bir Camgöbeği floresan protein ifade, Gap43, EF1α organizatör ve bir hegzamer tarafından tahrik DF4 PAX6 artırıcı elemanı her yerde objektif fiber hücreler11. Q01 Retina içindeki amacrin hücreleri de dahil olmak üzere ekstra Lenticular ifade var, birincil faiz objektif ise arka plan sinyali ekler. Biz herhangi bir ekstra merceksi sinyal kaçınarak amacı ile özellikle objektif bir membran gergin mApple ifade eden bir roman transjenik çizgi geliştirdik.
Objektif çekirdeği lokalizasyonu
Biz objektif çekirdeğinin larva zebra balığı ilk anterior konumdan yetişkin lensler anterior-posterior ekseninde merkezi bir konuma hareket keşfetti. Yüksek refraktif indeks objektif çekirdeğinin pozisyonunda bu vardiya zebra balığı lens optik1normal gelişimi için bir şart olduğu düşünülmektedir. Yöntemlerimiz lens yarıçapı ile ilgili olarak objektif nükleer merkezileştirmenin ölçülmesine olanak sağlar. Bu yöntemi kullanarak, Aqp0a objektif nükleer merkezileştirme1için gerekli olduğunu gösterdi ve bu basit yöntem objektif geliştirme ve fizyolojisi ve zebra balığı modelinde optik özellikleri diğer çalışmalara uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebra balığı objektif morfoloji Analizi mutantlar fenotipleri anlamada ilk adımdır, ya da oküler objektif biyoloji okumaya yönelik farmakolojik müdahalelerin etkileri. Objektif sütürler, kortikal fiber hücre morfolojisi ve objektif çekirdeğinin yönlerini analiz etmek için yöntemleri özetlemektedir. Bu yaklaşımlar in vitro ve In vivo ( tablo 1 ‘ de karşılaştırıldığında) bir kombinasyonudur. In vitro yöntemleri dış kortikal hücre morfolojisi daha fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz finansman kaynağı kabul etmek istiyorum: NIH R01 EY05661 J. E. H için, Ines Gehring aqp0a/b çift mutantlar ve zebra balığı yetiştiriciliği üreten ile yardımcı olmak için, Dr Daniel dranow tartışmalar için transgenics nesil lider, Dr Bruce Blumberg ve Dr Ken Cho ‘s Labs onların diseksiyon microscopes kullanımı için, ve Dr Megan Smith istatistiksel analiz yardım için.
Materials
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21˚C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont # 5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION – toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
References
- Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
- Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
- Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
- Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
- Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
- Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).
- Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. 261, 59-94 (2002).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
- Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
- Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
- Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
- Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
- Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
- Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
- Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
- Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
- Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
- Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
- Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
