Évaluation de la localisation des noyaux de lentilles zebrafish et de l’intégrité suturale
Summary
Ces protocoles ont été élaborés pour analyser la morphologie des lentilles corticales, l’intégrité structurale des sutures de lentilles poisson zèbre dans les lentilles fixes et vivantes et pour mesurer la position du noyau de lentille de zébrafish le long de l’axe antérieur-postérieur.
Abstract
Le zébrafish est particulièrement adapté à la manipulation génétique et à l’imagerie in vivo , ce qui en fait un modèle de plus en plus populaire pour les études génétiques inverses et pour la production de transgénics pour l’imagerie in vivo . Ces capacités uniques font du poisson zèbre une plate-forme idéale pour étudier le développement de lentilles oculaires et la physiologie. Nos récentes découvertes qu’un aquaporin-0, Aqp0a, est nécessaire pour la stabilité de la suture de lentille antérieure, ainsi que pour le déplacement du noyau de l’objectif au centre de lentilles avec l’âge nous a conduit à développer des outils particulièrement adaptés à l’analyse des propriétés des lentilles poisson zèbre. Ici, nous décrions des méthodes détaillées pour la dissection lentille qui peut être appliquée à la fois larvaire et lentilles adultes, pour les préparer pour l’analyse histologique, immunohistochimie et l’imagerie. Nous nous concentrons sur l’analyse de l’intégrité des suture des lentilles et la morphologie des cellules corticales et comparons les données générées à partir de lentilles disséqué avec des données obtenues à partir de l’imagerie in vivo de la morphologie des lentilles rendue possible par une nouvelle lignée de zébrafish transgénique avec un génétiquement marqueur fluorescent codé. L’analyse des lentilles disséqué perpendiculaires à leur axe optique permet de quantifier la position relative du noyau de l’objectif le long de l’axe antérieur-postérieur. Le mouvement du noyau d’objectif d’une position antérieure initiale au centre est exigé pour l’optique normale de lentille dans le zebrafish adulte. Ainsi, une mesure quantitative de la position nucléaire de lentille est directement corrélée avec ses propriétés optiques.
Introduction
Le poisson zèbre est un excellent modèle pour étudier le développement de lentilles et la physiologie en raison des similitudes anatomiques aux lentilles mammaliennes, la facilité relative de manipulation génétique et pharmacologique, la vitesse du développement des yeux embryonnaires, la petite taille et la transparence à des stades précoces permettant l’imagerie in vivo . Les méthodes décrites ici ont été développées pour analyser la morphologie des lentilles de zébrafish aux stades embryonnaires et adultes, en se concentrant sur l’intégrité suturale, la morphologie membranaire corticale in vitro et in vivo, et l’emplacement de la position nucléaire de l’objectif le long de la l’axe antérieur-postérieur ex vivo. Ces méthodes servent de point de départ pour les études fonctionnelles du développement de lentilles et de la physiologie, ainsi que des écrans génétiques inverses pour les phénotypes de lentilles dans le zébrafish.
Imagerie de la morphologie des lentilles poisson zèbre
Aquaporin 0 (AQP0) est la protéine la plus abondante de membrane de lentille et est critique pour le développement de lentille et la clarté, en raison de multiples fonctions essentielles chez les mammifères. Zebrafish ont deux Aqp0s (Aqp0a et Aqp0b) et nous avons développé des méthodes pour analyser la perte de leurs fonctions dans les lentilles embryonnaires et adultes. Nos études révèlent que les mutants aqp0a-/-développent l’opacité polaire antérieure en raison de l’instabilité de la suture antérieure, et que les mutants doubles aqp0a/b développent l’opacité nucléaire1. AQP0 a été montré à jouer des rôles dans le transport de l’eau2, l’adhérence3,4, l’ancrage cytosquelettique5 et la génération du gradient de l’indice de réfraction6, mais ces études ont été largement réalisées dans et non vitro. Le zébrafish offre une occasion unique d’étudier comment la perte de fonction, ou la fonction perturbée de Aqp0a ou Aqp0b affecterait la morphologie et la fonction dans un objectif vivant. Pour évaluer la morphologie des cellules de lentilles et l’intégrité de la suturie pendant le développement, nous avons modifié les méthodes immunohistochimiques in vitro existantes7 pour les lentilles embryonnaires et adultes et avons généré des transgéniques pour surveiller ce processus in vivo .
L’analyse immunohistochimique de la structure membranaire plasmatique et l’intégrité suturale ont été effectuées dans des embryons fixes entiers et des lentilles adultes. Les lentilles zebrafish sont extrêmement petites (le diamètre de l’objectif est ~ 100 μm dans les embryons et jusqu’à 1 mm chez les adultes) par rapport à leurs homologues mammifères et ont des sutures ponctuelles8, qui sont rarement capturées dans les Cryosections. Ainsi, les lentilles entières sont essentielles pour l’analyse de l’intégrité suturale. Pour l’analyse in vivo de la formation de suture antérieure et l’imagerie de l’architecture de cellules de lentilles précises, nous avons généré des transgéniques exprimant spécifiquement des membranes d’objectif de Mapple.
Les avantages de l’imagerie en direct des transgéniques membranaires de l’objectif comprennent: 1) éviter les artefacts de fixation, 2) étudier les changements morphologiques dynamiques dans les films Time-lapse, et 3) permettre des études longitudinales dans lesquelles des événements antérieurs peuvent être corrélés avec plus tard Phénotypes. La pigmentation de l’iris empêche normalement l’imagerie claire de la périphérie de l’objectif. L’addition de 1-phényl 2-thiourea (PTU) avant l’étape9 du primordia-5 (Prim-5) prévient la mélanogenèse et la pigmentation oculaire jusqu’à environ 4 jours après la fécondation (DPF). Cependant, après 4 DPF, la périphérie de la lentille est obscurcie in vivo, enparticulier à des stades plus anciens. En outre, la densité de la lentille elle-même obscurcit l’imagerie de son pôle postérieur. Par conséquent, pour étudier la morphologie de la périphérie de la lentille, ou la suture postérieure, après 4 DPF, les lentilles doivent être excisées et fixées.
Des lignées de zébrafish transgéniques ont été utilisées pour analyser la structure membranaire des lentilles embryonnaires in vivo10. Le transgénique Q01 exprime une protéine fluorescente cyan fusionnée à une séquence de ciblage membranaire, Gap43, entraînée par le promoteur EF1α et un hexamère de l’élément Df4 Pax6 Enhancer façon ubiquitaire dans les cellules de fibre optique11. Q01 a l’expression extra-lenticulaire, y compris les cellules d’amacrines dans la rétine, qui ajoute le signal d’arrière-plan si l’intérêt principal est l’objectif. Nous avons développé une nouvelle ligne transgénique qui exprime une mApple membranaire spécifiquement dans la lentille, dans le but d’éviter tout signal extra-lenticulaire.
Localisation du noyau de l’objectif
Nous avons découvert que le noyau de l’objectif se déplace d’un emplacement antérieur initial dans le zébrafish larvaire à un emplacement central dans l’axe antérieur-postérieur dans les lentilles adultes. Ce changement dans la position du noyau de lentille de l’indice de réfraction élevé est considéré comme une exigence pour le développement normal de l’optique de lentille de zébrafish1. Nos méthodes permettent de quantifier la centralisation nucléaire de l’objectif par rapport au rayon de l’objectif. En utilisant cette méthode, nous avons montré que Aqp0a est nécessaire pour la centralisation de la lentille nucléaire1, et cette méthode simple peut être appliquée à d’autres études sur le développement et la physiologie de l’objectif et ses propriétés optiques dans le modèle de zébrafish.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analyse de la morphologie des lentilles poisson zèbre est la première étape dans la compréhension des phénotypes chez les mutants, ou les effets des interventions pharmacologiques visant à étudier la biologie de la lentille oculaire. Nous décrions des méthodes pour analyser les sutures de lentilles, la morphologie des cellules en fibres corticales et les aspects du noyau de l’objectif. Ces approches sont une combinaison de in vitro et in vivo (comparé dans le tableau 1)….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous aimerions souligner notre source de financement: NIH R01 EY05661 à J.-c., ines-c. H. pour avoir aidé à générer les mutants doubles aqp0a/b et l’élevage de zébrafish, le Dr Daniel Dranow pour les discussions menant à la génération des transgéniques, le Dr Bruce Les laboratoires de Blumberg et de Dr Ken Cho pour l’utilisation de leurs microscopes dissécants, et le Dr Megan Smith pour l’aide à l’analyse statistique.
Materials
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21˚C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont # 5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION – toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
References
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