ゼブラフィッシュレンズ核局在化と Sutural 整合性の評価
Summary
これらのプロトコルは、皮質レンズの形態を分析するために開発された、固定および生きているレンズにおけるゼブラフィッシュレンズ縫合の構造的完全性、および前後部軸に沿ったゼブラフィッシュレンズ核の位置を測定する。
Abstract
ゼブラフィッシュは、遺伝子操作や生体内イメージングに適しており、逆遺伝子研究や in vivoイメージングのための transgenics の生成において、ますます普及しているモデルとなっています。これらのユニークな機能は、ゼブラフィッシュを眼レンズの開発と生理学を研究する理想的なプラットフォームにします。我々の最近の知見は、アクアポリン-0, Aqp0a は、前眼レンズ縫合の安定性のために必要なだけでなく、加齢に伴うレンズ中心へのレンズ核のシフトのために、ゼブラフィッシュレンズの特性を分析するのに適したツールを開発することに導いた。ここでは、幼虫と成体の両方のレンズに適用することができるレンズ解離の詳細な方法を概説し、組織学的分析、免疫組織化学および画像化のためにそれらを準備する。私たちは、レンズ縫合糸の完全性と皮質細胞の形態の分析に焦点を当て、遺伝子組み換えゼブラフィッシュによって可能になったレンズ形態のin vivoイメージングから得られたデータと解剖レンズから生成されたデータを比較する蛍光マーカーを符号化。軸方向に垂直に切開したレンズの分析により、前後部軸に沿ったレンズ核の相対位置を定量化することができます。初期の前方位置から中心へのレンズ核の移動は、成人ゼブラフィッシュにおける通常のレンズ光学に必要である。したがって、レンズ核位置の定量的測定値は、その光学的特性と直接相関する。
Introduction
ゼブラフィッシュは、哺乳類のレンズとの解剖学的類似のため、レンズ開発と生理学を研究するための優れたモデルであり、遺伝的および薬物操作の相対的な容易さ、胚眼の発達速度、小さなサイズおよび透明性初期段階では in vivoイメージングを可能にする。ここに記述された方法は、sutural 完全性、インビトロおよびインビボにおける皮質膜形態、およびレンズ核位置の位置に焦点を当てた胚性および成体期におけるゼブラフィッシュレンズ形態を分析するために開発した前後部軸ex 生体。これらの手法は、レンズの発達と生理機能に関する研究の開始点として、またゼブラフィッシュにおけるレンズの表現型についての逆遺伝スクリーンを提供する。
ゼブラフィッシュのレンズ形態の画像化
アクアポリン 0 (AQP0) は、最も豊富なレンズ膜タンパク質で、哺乳動物の複数の必須機能により、レンズの開発と明瞭性の両方にとって重要です。ゼブラフィッシュには2つの Aqp0s (Aqp0a と Aqp0b) があり、それらの機能の欠損を胚と成人の両方のレンズで分析する方法を開発しました。私たちの研究では、 aqp0a/-変異体が前縫合線の不安定性による極性の前極性不透明度を発現し、 aqp0a/b二重変異体が核不透明度1を発現していることが明らかになった。AQP0 は、水輸送2において役割を果たすことが示されており、接着性3、4、細胞骨格固定5および屈折率勾配6の生成において、これらの研究は大部分で行われてきたインビトロ。ゼブラフィッシュは、Aqp0a や Aqp0b の機能の低下や摂動機能が、生きている水晶体の形態や機能にどのような影響を与えるかを研究する絶好の機会を提供します。開発中にレンズ細胞の形態および sutural の完全性を評価するために、我々は、胚および成体レンズでの使用のために既存のインビトロ免疫組織化法7を修飾し、そしてインビボでこのプロセスをモニターする transgenics を生成した.
原形質膜構造の免疫組織学的解析と sutural の完全性を、全固定胚と成体レンズで行った。ゼブラフィッシュレンズは、哺乳類と比較して非常に小さく (レンズの直径は約100μ m、成人では 1 mm まで)、公知ではほとんど捕捉されない点縫合線8を有する。したがって、sutural の完全性を分析するためには、全レンズが不可欠です。生体内での前縫合形成、精密レンズ細胞構造のイメージングにおいて、mApple 特異的に標識レンズ膜を発現する transgenics を生成した。
レンズ膜 transgenics のライブイメージングの利点は次のとおりです: 1) 固定アーチファクトの回避、2) タイムラプス映画の動的形態変化の研究、および 3) 以前のイベントを後で相関させることができる縦断的研究を可能にする表現。虹彩の色素沈着は、通常、レンズ周辺の鮮明な撮像を防止する。原基-5 (プリム-5) ステージ9の前に 1-フェニル 2-チオ尿素 (PTU) を添加すると、約4日間 postfertilization (dpf) までのメラニン形成および眼の色素沈着を防止する。しかし、4つの dpf の後、レンズ周辺は、特に古い段階でインビボで不明瞭になる。さらに、レンズ自体の密度は、その後の極の画像化を覆い隠します。したがって、レンズ周辺の形態、または後縫合線を研究するために、4 dpf の後に、レンズを摘出し、固定する必要がある。
トランスジェニックゼブラフィッシュ線は、インビボ10における胚性レンズ膜構造を分析するために使用されてきた。Q01トランスジェニックとは、膜ターゲティング配列に融合したシアン蛍光タンパク質を発現し、Gap43、 EF1αプロモーターおよび hexamer によって駆動される DF4 pax6エンハンサーは、レンズ繊維細胞11に遍在する。Q01は、主な関心がレンズである場合、バックグラウンドシグナルを追加する網膜のアマクリン細胞を含む、余分なレンズを持っています。私たちは、レンズに特に立体的な信号を避けることを目的として、膜連結された mApple を特異的に表現する新しいトランスジェニック線を開発しました。
レンズ nucleus ローカリゼーション
我々は、レンズ核が、幼虫ゼブラフィッシュにおける最初の前方の位置から、成人用レンズの前後部軸の中心位置に移動することを発見した。この高屈折率レンズ核の位置におけるこのシフトは、ゼブラフィッシュレンズ1の正常な開発のための必要条件であると考えられる。レンズの半径に関しては、レンズ核集中化の定量化が可能です。この方法を用いて、Aqp0a がレンズ核中央1に必要であることを示し、この簡便な方法は、ゼブラフィッシュモデルにおけるレンズの発達と生理学の他の研究に応用できる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュレンズ形態の分析は、変異体における表現型、または眼レンズの生物学を研究することを目的とする薬理学的介入の効果を理解する上での最初のステップである。レンズ縫合、皮質繊維細胞の形態、レンズ核の側面を分析する方法を概説します。これらのアプローチは、インビトロおよびインビボでの組み合わせである (表1 に比べた)。インビ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは資金源を確認したいと思います: ゲーリングの NIH R01 EY05661、 aqp0a/bの二重変異体とゼブラフィッシュの畜産の生成を支援するためのイネス博士は、Dranow の生成につながる議論のためにダニエル・ transgenics 医師、ブルース博士ブルンバーグと博士の解剖顕微鏡の使用のための研究所とメガン・スミス博士は、統計分析の助けを借りています。
Materials
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21˚C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont # 5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION – toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
References
- Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
- Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
- Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
- Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
- Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
- Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).
- Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. 261, 59-94 (2002).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
- Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
- Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
- Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
- Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
- Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
- Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
- Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
- Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
- Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
- Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
- Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
