제 브라 피쉬 렌즈의 평가 핵 현지화 및 조직 무결성
Summary
이러한 프로토콜은 피 질 렌즈 형태학을 분석 하기 위해 개발 되었으며, 고정 및 라이브 렌즈에서 제 브라 피시 렌즈 봉합 사의 구조적 완전성을 측정 하 고, 전방 후부 축을 따라 제 브라 피시 렌즈 핵의 위치를 측정할 수 있다.
Abstract
Zebrafish는 유전 조작 및 생체 내 이미징에 유일 하 게 적합 하며 역 유전 연구와 생체 내 이미징에 대 한 transgenics 생성을 위한 점점 더 인기 있는 모델입니다. 이러한 독특한 기능은 제 브라 피시 안구 렌즈 개발과 생리학을 연구 하는 이상적인 플랫폼을 만든다. 우리의 최근 발견 된 아쿠아 포린-0, Aqp0a, 전방 렌즈의 안정성을 위해 요구 되는 봉합 사, 뿐만 아니라 렌즈 핵의 시프트에 대 한 렌즈 중심을 나이에 우리는 zebrafish 렌즈의 특성을 분석 하는 데 특히 적합 한 도구를 개발 하기 위해 우리를 이끌었다. 여기에서 우리는 조직 학적 분석, 면역 조직 화학 및 이미징을 위해 준비 하기 위해 애벌레 및 성인용 렌즈 모두에 적용 할 수 있는 렌즈 해 부에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. 우리는 렌즈 봉합 사 무결성 및 대뇌 피 질의 세포 형태학의 분석에 집중 하 고 유전적으로 새로운 형질 전환 zebrafish 라인에 의해 가능 하 게 만든 렌즈 형태학의 생체 내 이미징에서 얻은 데이터로 해 부 렌즈에서 생성 된 데이터를 비교 인코딩된 형광 표식입니다. 광 축에 수직인 해 부 렌즈의 분석을 통해 전방 후부 축을 따라 렌즈 핵의 상대적인 위치를 정량화 할 수 있습니다. 렌즈 핵을 초기 전방 위치에서 중심으로 이동 하는 것은 성인 제 브라 피시의 일반 렌즈 광학에 필요 합니다. 따라서, 렌즈 핵 위치를 정량적으로 측정 하는 것은 광학적 특성과 직접적으로 관련이 있습니다.
Introduction
제 브라 피쉬는 포유류 렌즈에 대 한 해부학 적 유사성, 유전 및 약리 조작의 상대적인 용이성, 배아 눈 발달 속도, 작은 크기 및 투명성으로 인해 렌즈 개발과 생리학을 연구 하는 훌륭한 모델입니다 초기 단계에서 생체 내 이미징에 대 한 허용. 여기에 설명 된 방법은 조직 무결성에 초점을 맞춘 배아 및 성인 단계에서 zebrafish 렌즈 형태학을 분석 하기 위해 개발 되었으며, 체 외 및 생체내에서의 대뇌 피 질 막 형태학 및 렌즈 핵 위치의 위치 전방-후부 축 ex 생체 내. 이러한 방법은 렌즈 개발 및 생리학의 기능적 연구를 위한 출발점으로 서, zebrafish의 렌즈 표현 형에 대 한 역 유전 화면 역할을 합니다.
이미징 제 브라 피시 렌즈 형태학
아쿠아 포린 0(AQP0)은 가장 풍부한 렌즈 멤브레인 단백질 이며 포유류의 여러 필수 기능으로 인해 렌즈 개발과 선명도 모두에 중요 합니다. 제 브라 피쉬는 두 개의 Aqp0s (Aqp0a 및 Aqp0b)를가지고 있으며 배아 및 성인 렌즈 모두에서 기능 상실을 분석 하는 방법을 개발 했습니다. 우리의 연구 결과에 따르면aqp0a-/-돌연변이 체는 전방 봉합 사의 불안정성으로 인해 전방 극성 불투명도를 개발 하 고 aqp0a/b 이중 돌연변이는 핵 불투명도1을 개발 합니다. AQP0는 물 수송2, 접착 력3,4, 세포 골격 고정5 및 굴절률 구배6의 생성에서 역할을 하는 것으로 알려져 있으 나 이러한 연구는 크게 시험관. 제 브라 피쉬는 살아있는 렌즈의 형태와 기능에 영향을 미치는 기능 상실 또는 Aqp0a 또는 Aqp0b의 교란 기능에 대해 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공 합니다. 개발 중에 렌즈 셀 형태학 및 조직 무결성을 평가 하기 위해, 우리는 배아 및 성인 렌즈에 사용 하기 위한 시험관 내 면역 세포 화학적 방법7 을 수정 하 고, 생체 내에서이 과정을 모니터링 하기 위해 트랜스 젠 시를 생성 .
면역 조직 화학적 분석은 혈장 막의 구조 및 수 중 무결성을 전체 고정 배아 및 성인 렌즈에서 수행 하였다. 제 브라 피시 렌즈는 매우 작은 (렌즈 직경은 태아에서 ~ 100 µm 및 성인에서 1 mm까지) 그들의 포유류 대조 군과 비교 하 여 점 봉합 사 (8)가 자주 저온 단면에서 포착 됩니다. 따라서 전체 렌즈는 조직 무결성을 분석 하는 데 필수적입니다. 전방 봉합 사 형성 및 정밀한 렌즈 셀 구조의 이미징에 대 한 생체 내 분석을 위해, 우리는 특히 렌즈 멤브레인을 라벨링 mapple을 표현 transgenics를 생성 했습니다.
렌즈 멤브레인 트랜스 젠 시의 라이브 이미징의 장점: 1) 고정 아티팩트를 피하고, 2) 타임 랩 스 영화의 동적 형태학 적 변화를 연구 하 고, 3) 이전 이벤트를 나중에 상호 연관 시킬 수 있는 종단 연구 활성화 고기. 홍 채의 색소 침착은 일반적으로 렌즈 주변부의 선명한 이미징을 방지 합니다. 1-페 닐 2 티 오 요소 (PTU)의 첨가 전에 프리모 르 디 아-5(프림) 단계9 는 멜 라 닌 생성 및 눈 색소 침착을 약 4 일 후에 (dpf)까지 방지 한다. 그러나 4 dpf 이후, 렌즈 주변부는 생체 내, 특히 구형 단계에서 가려집니다. 또한 렌즈 자체의 밀도는 후방 극의 이미징을 모호 하 게 합니다. 따라서 렌즈 주변부의 형태학을 연구 하거나 후부 봉합을 하 여 4 dpf 후에 렌즈를 절제 하 고 고정 시켜야 합니다.
제 브라이 선 형질 전환 체는 생체 내10 의배아 렌즈 막 구조를 분석 하는데 사용 되어 왔다. 상기 Q01 형질 전환 체는 렌즈 섬유 세포 (11)에서 DF4 pax6 증강 요소 ubiquitously의 EF1α 프로모터 및 hexamer에 의해 구동 되는 , Gap43의 멤브레인 표적화 서 열에 융합 된 시안 형광 단백질을 표현 한다. Q01 에는 망막의 무 축 삭 세포를 포함 한 추가적인 렌즈 표현이 있어 주요 관심사 인 경우 배경 신호를 추가 합니다. 우리는 여분의 렌즈 모양 신호를 피하는 것을 목표로 하 여 렌즈에 특별히 멤브레인 테더를 표현 하는 새로운 트랜스 제 닉 라인을 개발 했습니다.
렌즈 핵 현지화
우리는 렌즈 핵이 애벌레 zebrafish의 초기 전방 위치에서 성인 렌즈의 전방 후부 축의 중앙 위치로 이동 한다는 것을 발견 했습니다. 이러한 고 굴절 렌즈 핵의 위치 변화는 제 브라 피시 렌즈 광학1의 정상적인 발달에 요구 되는 것으로 생각 된다. 우리의 방법은 렌즈 반경과 관련 하 여 렌즈 핵 중앙 집중화를 정량화 할 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 Aqp0a가 렌즈 핵 중앙 집중화1에 필요 하다는 것을 보여 주었고,이 간단한 방법은 제 브라 피쉬 모델에서의 렌즈 및이의 광학 특성의 발달 및 생리학에 대 한 다른 연구에도 적용 될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제 브라 피시 렌즈 형태학의 분석은 돌연변이 체의 표현 형을 이해 하는 초기 단계, 또는 안구 렌즈의 생물학을 연구 하기 위한 약리학 적 개입의 효과입니다. 렌즈 봉합, 대뇌 피 질 섬유 세포 형태학 및 렌즈 핵의 측면을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 접근법은 시험관 내 및 생체 내에서의 조합 ( 표 1과 비교 하 여) 이다. 시험관 내 방법은 외부 피 질 세포…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 우리의 자금 출처를 인정 하 고 싶습니다: NIH R01 EY05661에 게 J. H, 네 스 Gehring aqp0a/b 이중 돌연변이와 zebrafish를 생성 하는 것을 돕기 위한, 박사 다니엘 Dranow transgenics의 세대에 이르는 논의를 위해, 브루스 박사 블 룸 베르크와 박사는 하 부 현미경 사용을 위한 연구소와 미 건 스미스 박사는 통계 분석에 도움을 주었습니다.
Materials
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21˚C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont # 5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION – toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
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