Summary

Оценка «локализация ядра» и «культурное целостность» Зебрая

Published: May 06, 2019
doi:

Summary

Эти протоколы были разработаны для анализа морфологии коры головного хрусталика, структурную целостность швами рыбы данио рерио в фиксированных и живых линз и для измерения положения ядра рыбы объектива данио, по передней задней оси.

Abstract

В данио рыба уникально подходит для генетических манипуляций и в естественных условиях визуализации, что делает его все более популярной моделью для обратного генетических исследований и для генерации transgenics для в естественных условиях визуализации. Эти уникальные возможности делают рыбу данио идеальной платформой для изучения развития и физиологии глазной линзы. Наши недавние выводы о том, что Аквапорин-0, Aqp0a, необходим для устойчивости шва переднего объектива, а также для смещения ядра объектива к центру объектива с возрастом привели нас к разработке инструментов, особенно подходящих для анализа свойств рыб-рыбок данио. Здесь мы очертить подробные методы рассечения объектива, которые могут быть применены как для личинок и взрослых линз, чтобы подготовить их для гистологического анализа, иммуногистохимии и визуализации. Мы фокусируемся на анализе целостности линз шва и морфологии клеток корковых и сравнить данные, полученные от расчлененных линз с данными, полученными в естественных условиях визуализации морфологии объектива стало возможным благодаря новой трансгенной рыбы-данио линии с генетически закодированный флуоресцентный маркер. Анализ расчлененных линз, перпендикулярных их оптической оси, позволяет количественно определять относительное положение ядра объектива вдоль передней-задней оси. Движение ядра объектива от начального переднего положения к центру необходимо для нормальной оптики объектива у взрослых рыб данио. Таким образом, количественная мера ядерной позиции объектива напрямую коррелирует с его оптическими свойствами.

Introduction

Рыба данио является отличной моделью для изучения развития и физиологии объектива из-за анатомического сходства с объективами млекопитающих, относительной легкости генетических и фармакологических манипуляций, скорости эмбрионального развития глаз, небольшого размера и прозрачности на ранних стадиях, позволяющий в естественных условиях визуализации. Методы, описанные здесь были разработаны для анализа морфологии рерио рыбы объектива в эмбриональных и взрослых этапах с акцентом на культурной целостности, корковых мембранных морфологии в пробирке и в естественныхусловиях, и местоположение объектива ядерной позиции вдоль передней задней оси ex естественныхусловиях. Эти методы служат отправной точкой для функциональных исследований развития и физиологии линз, а также обратных генетических экранов для фенотипов объектива в рыбе данио.

Морфология рыб изображения данио зебрая

Аквапорин 0 (AQP0) является наиболее распространенным белком мембранный объектив и имеет решающее значение для обоих, объектив развития и ясности, из-за нескольких основных функций у млекопитающих. У рыбы данио есть два Aqp0s (Aqp0a и Aqp0b), и мы разработали методы анализа потери их функций как в эмбриональных, так и взрослых объективах. Наши исследования показывают, чтоaqp0a-/-мутанты развивают переднюю полярную непрозрачность из-за нестабильности переднего шва, и aqp0a/b Двойные мутанты развивают ядерную непрозрачность1. AQP0 было показано, играть роли в водный транспорт2, адгезия3,4, цитоскелетная якорь5 и генерация градиента индекса преломления6, но эти исследования в значительной степени были выполнены в пробирке. Рыба данио дает уникальную возможность изучить, как потеря функции, или Возмущенные функции Aqp0a или Aqp0b повлияет на морфологию и функции в живых линз. Для оценки морфологии клеток объектива и культурной целостности во время разработки, мы модифицировали существующие в пробирке иммуногистхимических методов7 для использования в эмбриональных и взрослых линз, и генерируемые трансгенов, чтобы контролировать этот процесс в естественных условиях .

Иммуногистизухимический анализ структуры мембраны плазмы и культурной целостности был выполнен в цельных фиксированных эмбрионах и взрослых объективах. Линзы зебрая рыбы чрезвычайно малы (диаметр объектива ~ 100 мкм в зародыши и до 1 мм у взрослых) по сравнению со своими коллегами млекопитающих и имеют точешвы8, которые редко улавливаются в криометазах. Таким образом, целые линзы необходимы для анализа культурной целостности. Для в естественных условиях анализ формирования переднего шва, и визуализации точной архитектуры клеток объектива, мы генерируются transgenics выражая Mapple конкретно маркировки линз мембраны.

Преимущества живой визуализации transgenics мембраны объектива включают в себя: 1) избежать фиксации артефактов, 2) изучение динамических морфологических изменений в покадровой фильмов, и 3) позволяет продольных исследований, в которых ранее события могут быть коррелированы с более поздней Фенотипов. Пигментация радужки обычно предотвращает четкое изображение периферии объектива. Добавление 1-фенил 2-тиуреа (PTU) до Примордия-5 (прим-5) стадия9 предотвращает Меланогенез и пигментацию глаз до примерно 4 дней постоплодотворения (DPF). Однако, после 4 DPF, периферия объектива скрыта в естественныхусловиях, особенно на старших стадиях. Кроме того, плотность объектива сама затемняет изображения его заднего полюса. Поэтому, чтобы изучить морфологию периферии объектива, или задний шов, после 4 DPF, линзы должны быть иссечено и исправлено.

Трансгенные линии рыбы данио были использованы для анализа эмбриональных мембранные структуры объектива в естественныхусловиях10. Q01 трансгенных выражает голубого флуоресцентного белка сливается с мембраны таргетинга последовательности, Gap43, движимый EF1α промоутер и гексамера DF4 PAX6 усилитель элемента повсеместно в линзы волокна клетки11. Q01 имеет экстра-линзовидные выражения, в том числе амакрин клеток в сетчатке, которая добавляет фоновый сигнал, если основной интерес является объектив. Мы разработали новую трансгенную линию, которая выражает мембранно-привязку mApple специально в объективе, с целью избежать любого экстра-линзовидные сигнала.

Локализация ядра объектива

Мы обнаружили, что ядро объектива перемещается из первоначального переднего расположения в личиночной данио, к центральному расположению в передней-задней оси во взрослых линз. Этот сдвиг в положении ядра объектива преломления индекса, как полагают, является требованием для нормального развития рыбы-объектива зебрано-оптики1. Наши методы позволяют количественно определять ядерную централизацию объектива по отношению к радиусу объектива. Используя этот метод, мы показали, что Aqp0a требуется для объектива ядерная централизация1, и этот простой метод может быть применен к другим исследованиям развития и физиологии объектива и его оптических свойств в модели рыбы данио.

Protocol

Животных протоколов, используемых в этом исследовании придерживаются ARVO заявление по использованию животных в офтальмологических и Vision исследований и были одобрены институционального ухода за животными и Комитета по использованию (ИАКУК) Калифорнийского университета в Ирвине. </…

Representative Results

Анатомия взрослой рыбы в глазном зебрае очень напоминает млекопитающих (рис. 1a). Несмотря на некоторые различия между рыбами данио и млекопитающихся глаз, таких, как с ресеплярной зоны вместо ресницах тела17, различия в оптических свойств<sup…

Discussion

Анализ морфологии линзы данио рерио является начальным шагом в понимании фенотипов в мутантах, или эффекты фармакологических вмешательств, направленных на изучение биологии глазной линзы. Мы обрисовать методы для анализа швов объектива, корковых морфологии клеток волокна и аспекты о…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы отметить наш источник финансирования: низ R01 EY05661 к J. E. H, Инес Герринг для оказания помощи в генерации aqp0a/b двойных мутантов и рерио рыбоводства, д-р Даниэль Дранов для дискуссий, ведущих к генерации transgenics, д-р Брюс Лаборатории Блумберга и доктора Кена Чо для использования их анатомический микроскопов, и д-р Меган Смит за помощью в статистическом анализе.

Materials

1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P7629 CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 157-4 CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Cryostat Leica CM3050S Objective and chamber temperature set to -21˚C
DAPI Invitrogen D1306 CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128 CAUTION – combustible, penetrates skin 
Disposable base mold VWR Scientific 15154-631
Disposable Pasteur glass pipets Fisherbrand 13-678-20A
Dumont # 5 forceps Dumont & Fils Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040 CAUTION – toxic
Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass) MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Glycerol Sigma G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct Addgene ID:122451
ImageJ Wayne Rasband, NIH v1.51n
Low Melt Agarose (LMA) Apex 902-36-6
NIS-Elements Nikon V 4.5
NIS-Elements AR software Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller Olympus Corp DP70
Olympus microscope  Olympus Corp SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546 Thermo Fisher A22283
Phenol Red indicator (1% w/v) Ricca Chemical Company 5725-16
Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399
Photoshop Adobe CS5 v12.0
Photoshop software Adobe CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective Nikon
Power source Wild Heerbrugg MTr 22 Or equivalent power source 
Slide warmer model No. 26020FS Fisher Scientific 12-594
Sodium Hydroxide beads Fisher Scientific S612-3 CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning World Prevision Instruments SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Triton X-100 BioXtra Sigma T9284 CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors Ted Pella Inc 1346 Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium Vector laboratories H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 Life Technologies W11262

References

  1. Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
  2. Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
  3. Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
  4. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
  5. Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
  6. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
  7. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
  8. Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
  9. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  10. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
  11. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  12. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).
  13. Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. 261, 59-94 (2002).
  14. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  15. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  16. Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
  17. Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
  18. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
  19. Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
  20. Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
  21. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
  22. Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
  23. Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
  24. Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
  25. Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
  26. Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
  27. Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
  28. Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
  29. Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
  30. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).

Play Video

Cite This Article
Vorontsova, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity. J. Vis. Exp. (147), e59528, doi:10.3791/59528 (2019).

View Video