Bruke nær-infrarød fluorescens og høyoppløselig skanning å måle protein uttrykk i gnagere Brain
Summary
Her presenterer vi en protokoll som bruker nær-infrarøde fargestoffer i forbindelse med immunhistokjemi og høyoppløselig skanning til analysen proteiner i hjernen regioner.
Abstract
Nevrovitenskap er studiet av hvordan cellene i hjernen megle ulike funksjoner. Måle protein uttrykk i neurons og glia er avgjørende for studiet av nevrovitenskap som cellulær funksjon bestemmes av sammensetningen og aktiviteten av cellulære proteiner. I denne artikkelen beskriver vi hvordan immuncytokjemi kan kombineres med nesten infrarød høyoppløselig skanning for å gi en semi-kvantitativ måling av protein uttrykk i forskjellige hjerneområder. Denne teknikken kan brukes for enkle eller doble protein uttrykk i samme hjernen regionen. Måle proteiner på denne måten kan brukes til å få en relativ endring i protein uttrykk med en eksperimentell manipulasjon, molekylær signatur av læring og hukommelse, aktivitet i molekylær trasé, og nevrale aktivitet i flere hjerneområder. Ved hjelp av riktige proteiner og statistisk analyse kan funksjonell tilkobling mellom hjerneregioner også fastslås. Gitt den enkle implementeringen av immuncytokjemi i et laboratorium, kan bruk av immuncytokjemi med nesten infrarød høyoppløselig skanning utvide muligheten av hjerneforsker til å undersøke nevrobiologiske prosesser på systemnivå.
Introduction
Studiet av nevrovitenskap gjelder en undersøkelse av hvordan cellene i hjernen megle bestemte funksjoner1. Disse kan være cellulære i naturen, for eksempel hvordan glia celler gir immunitet i sentralnervesystemet eller kan involvere eksperimenter som tar sikte på å forklare hvordan aktiviteten til nevroner i rygg hippocampus fører til romlig navigering. I en bred forstand, er cellulær funksjon bestemmes av proteiner som er uttrykt i en celle og aktiviteten til disse proteinene2. Som et resultat, måle uttrykk og/eller aktivitet av proteiner i hjerneceller er avgjørende for studiet av nevrovitenskap.
En rekke teknikker er tilgjengelige for å måle protein uttrykk i hjernen. Disse inkluderer in vivo-metoder som positron utslipps topografi for reseptor tetthet3 og mikro-dialyse for små peptider4. Mer vanlig, ex vivo metoder brukes til å undersøke protein funksjon og uttrykk. Disse inkluderer masse massespektrometri teknikker5, Western Blot og enzym-knyttet immunosorbentanalyse ANALYSEN (Elisa)6, og immuncytokjemi7. Immuncytokjemi er mye brukt i feltet av nevrovitenskap. Denne teknikken innebærer bruk av et primært antistoff for å oppdage et protein (eller antigen) av interesse (f. eks c-Fos) og et bøyd sekundært antistoff for å oppdage protein-primære antistoff kompleks (figur 1). For å muliggjøre påvisning av protein-primære antistoff-sekundære antistoff kompleks, sekundære antistoffer har Oksiderende stoffer som pepperrot peroksidase (HRP) bøyd til dem. Dette gir mulighet for dannelse av precipitates i celler som kan oppdages ved hjelp av lys mikroskopi7. Sekundære antistoffer kan også ha kjemikalier fluorescerer bøyd til dem (dvs. fluorophores). Når stimulert disse kjemikaliene avgir lys, som kan brukes til å oppdage protein-primære antistoff-sekundære antistoff komplekser7. Endelig, noen ganger primære antistoffer har redusere agenter og fluorescens kjemikalier knyttet til dem direkte benektende behovet for sekundære antistoffer7 (figur 1).
Interessant, mange immuncytokjemi metoder tillater visualisering av proteiner i hjerneceller, men ikke evnen til å kvantifisere mengden protein i en bestemt celle eller hjerne regionen. Bruk av lys mikroskopi for å oppdage precipitates fra reduksjons reaksjoner gir mulighet for visualisering av neurons og glia, men denne metoden kan ikke brukes til å kvantifisere protein uttrykk i celler eller i en bestemt hjerne region. I teorien kan fluorescens mikroskopi brukes til dette, fordi lyset som slippes ut fra det fluorescerende sekundære antistoff er et mål på protein-primære antistoff-sekundære antistoff kompleks. Men autofluorescence i hjernevevet kan gjøre det vanskelig å bruke fluorescens mikroskopi å kvantifisere protein uttrykk i hjernevevet8. Som et resultat, lys slippes ut fra fluorescerende bilder av hjernevevet er sjelden brukt til å kvantifisere protein uttrykk i hjernen.
Mange av disse problemene kan løses ved hjelp av nær-infrarød immuncytokjemi i forbindelse med høyoppløselig skanning9,10. I denne artikkelen beskriver vi hvordan immuncytokjemi kombinert med fluorophores i nær infrarød stråling Spectra kan kombineres med høyoppløselig skanning (for eksempel 10 – 21 μm) for å oppnå skarpe bilder som tillater semi kvantifisering av protein i forskjellige hjernen regioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Resultatene som presenteres i denne artikkelen viser at nær-infrarød immuncytokjemi i kombinasjon med høyoppløselig skanning kan brukes til å få semi-kvantitative målinger av protein uttrykk i hjernevevet. Den kan også brukes til å merke to proteiner samtidig i samme hjerne region. Vi har tidligere brukt nesten infrarød immunhistokjemi til å måle umiddelbare tidlige genuttrykk i flere hjerneområder9,10. Umiddelbare tidlige gener kan brukes som et må…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen i denne rapporten ble finansiert av et mål stipend fra NIGMS (1P20GM103653) tildelt DK.
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
References
- Kandel, E. R. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. . From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
