Utilisation de la fluorescence proche infrarouge et de la numérisation haute résolution pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs
Summary
Ici, nous présentons un protocole qui utilise des colorants quasi-infrarouges en conjonction avec l’immunohistochimie et la numérisation à haute résolution pour les protéines de dosage dans les régions du cerveau.
Abstract
La neuroscience est l’étude de la façon dont les cellules du cerveau médient diverses fonctions. La mesure de l’expression des protéines dans les neurones et la Glia est essentielle pour l’étude des neurosciences car la fonction cellulaire est déterminée par la composition et l’activité des protéines cellulaires. Dans cet article, nous décrivons comment l’immunocytochimie peut être combinée avec l’analyse à haute résolution proche infrarouge pour fournir une mesure semi-quantitative de l’expression des protéines dans les régions cérébrales distinctes. Cette technique peut être utilisée pour une expression de protéine simple ou double dans la même région cérébrale. Les protéines de mesure de cette façon peuvent être utilisées pour obtenir un changement relatif dans l’expression des protéines avec une manipulation expérimentale, la signature moléculaire de l’apprentissage et de la mémoire, l’activité dans les voies moléculaires, et l’activité neuronale dans plusieurs régions cérébrales. En utilisant les bonnes protéines et l’analyse statistique, la connectivité fonctionnelle entre les régions cérébrales peut également être déterminée. Étant donné la facilité de mise en œuvre de l’immunocytochimie dans un laboratoire, l’utilisation de l’immunocytochimie avec un balayage à haute résolution à infrarouge proche peut élargir la capacité du neuroscientifique à examiner les processus neurobiologiques au niveau des systèmes.
Introduction
L’étude des neurosciences concerne une enquête sur la façon dont les cellules du cerveau médient les fonctions spécifiques1. Ceux-ci peuvent être cellulaires dans la nature comme la façon dont les cellules gliales confèrent l’immunité dans le système nerveux central ou peuvent impliquer des expériences qui visent à expliquer comment l’activité des neurones dans l’hippocampe dorsal conduit à la navigation spatiale. Dans un sens large, la fonction cellulaire est déterminée par les protéines qui sont exprimées dans une cellule et l’activité de ces protéines2. En conséquence, la mesure de l’expression et/ou de l’activité des protéines dans les cellules cérébrales est essentielle pour l’étude des neurosciences.
Un certain nombre de techniques sont disponibles pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau. Il s’agit notamment de méthodes in vivo telles que la topographie des émissions de positrons pour les densités des récepteurs3 et la micro-dialyse pour les petits peptides4. Plus communément, les méthodes ex vivo sont utilisées pour examiner la fonction et l’expression des protéines. Il s’agit notamment de techniques de spectrométrie de masse5, de Western Blot et d’immunosorbant enzymatique (ELISA)6, et d’immunocytochimie7. L’immunocytochimie est largement utilisée dans le domaine des neurosciences. Cette technique implique l’utilisation d’un anticorps primaire pour détecter une protéine (ou un antigène) d’intérêt (p. ex. c-fos) et un anticorps secondaire conjugué pour détecter le complexe d’anticorps protéine-primaire (figure 1). Pour permettre la détection du complexe anticorps-secondaire anticorps-primaire de protéine, les anticorps secondaires ont des agents oxydants tels que la peroxydase de raifort (HRP) conjugués à eux. Cela permet la formation de précipités dans les cellules qui peuvent être détectées à l’aide de la microscopie photonique7. Les anticorps secondaires peuvent également avoir des substances chimiques fluorescentes conjuguées à elles (c.-à-d. fluorophores). Lorsqu’ils sont stimulés, ces produits chimiques émettent de la lumière, qui peut être utilisé pour détecter les complexes d’anticorps secondaires de protéine-primaire7. Enfin, parfois, les anticorps primaires ont des agents réducteurs et des produits chimiques de fluorescence attachés directement à la nécessité d’anticorps secondaires7 (figure 1).
Fait intéressant, de nombreuses méthodes d’immunocytochimie permettent la visualisation des protéines dans les cellules du cerveau, mais pas la capacité de quantifier la quantité de protéines dans une cellule spécifique ou une région du cerveau. L’utilisation de la microscopie photonique pour détecter les précipités des réactions de réduction permet de visualiser les neurones et les gliales, mais cette méthode ne peut pas être utilisée pour quantifier l’expression des protéines dans les cellules ou dans une région cérébrale spécifique. En théorie, la microscopie à fluorescence peut être utilisée pour cela, parce que la lumière émise par l’anticorps secondaire fluorescent est une mesure du complexe anticorps-secondaire anticorps-primaire de protéine. Cependant, l’autofluorescence dans le tissu cérébral peut rendre difficile l’utilisation de la microscopie de fluorescence pour quantifier l’expression des protéines dans le tissu cérébral8. Par conséquent, la lumière émise par les images fluorescentes du tissu cérébral est rarement utilisée pour quantifier l’expression des protéines dans le cerveau.
Beaucoup de ces questions peuvent être abordées en utilisant l’immunocytochimie proche infrarouge en conjonction avec la numérisation à haute résolution9,10. Dans cet article, nous décrivons comment l’immunocytochimie couplée avec les fluorophores dans les spectres d’émission proche infrarouge peut être combinée avec une numérisation à haute résolution (par exemple, 10 – 21 μM) pour obtenir des images nettes qui permettent une quantification semi-quantitative des protéines dans des régions du cerveau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les résultats présentés dans cet article montrent que la quasi-infrarouge immunocytochimie en combinaison avec la numérisation à haute résolution peut être utilisé pour obtenir des mesures semi-quantitatives de l’expression des protéines dans le tissu cérébral. Il peut également être utilisé pour étiqueter deux protéines simultanément dans la même région du cerveau. Nous avons déjà utilisé l’immunohistochimie près de l’infrarouge pour mesurer l’expression précoce immédiate des gènes dans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche dans ce rapport a été financée par une subvention cible de la NIGMS (1P20GM103653) attribuée à DK.
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
References
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