근 적외선 형광 및 고 분해능 주사를 사용 하 여 설치류 뇌의 단백질 발현 측정
Summary
여기서, 우리는 뇌 영역에서 단백질을 분석 하기 위해 면역 조직 화학 및 고해상도 스캔과 함께 근 적외선 염료를 사용 하는 프로토콜을 제시 합니다.
Abstract
신경 과학은 두뇌에 있는 세포가 각종 기능을 중재 하는 방법의 연구 결과입니다. 세포 기능이 세포 단백질의 조성과 활동에 의해 결정 되기 때문에 뉴런 및 글 리아에서 단백질 발현을 측정 하는 것은 신경 과학의 연구에 매우 중요 합니다. 이 기사에서는 면역 세포 화학이 근 적외선 고 분해능 스캔과 결합 되어 별개의 뇌 영역에서 단백질 발현에 대 한 반 정량 측정을 제공 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 동일한 뇌 영역에서 단일 또는 이중 단백질 발현에 사용 될 수 있다. 이러한 방식으로 단백질을 측정 하는 것은 실험 조작, 학습 및 기억력의 분자 서명, 분자 경로의 활성 및 여러 뇌 영역에서의 신경 활동으로 단백질 발현의 상대적인 변화를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 올바른 단백질과 통계 분석을 사용 하 여 뇌 영역 간의 기능적 연결성도 확인할 수 있습니다. 실험실에서 면역 세포 화학 작용의 용이성을 감안할 때, 근 적외선 고 분해능 스캐닝으로 면역 세포 화학을 사용 하는 것은 신경 과학자가 시스템 수준에서 신경 생물학 프로세스를 검사 하는 능력을 확장할 수 있습니다.
Introduction
신경 과학의 연구는 두뇌에 있는 세포가 특정 기능을 중재 하는 방법1에 대 한 조사에 관련 됩니다. 이러한 세포가 중추 신 경계에서 면역을 부여 하는 방법과 같은 자연에서 세포가 될 수 있거나 등 쪽 해 마에서 뉴런의 활동이 공간적 탐색으로 이어지는 방법을 설명 하는 것을 목표로 하는 실험을 포함 할 수 있습니다. 광범위 한 의미에서, 세포 기능은 세포에서 발현 되는 단백질 및 이들 단백질2의 활성에 의해 결정 된다. 결과적으로 뇌 세포에서 단백질의 발현 및/또는 활성을 측정 하는 것은 신경 과학의 연구에 중요 합니다.
두뇌에 있는 단백질 발현을 측정 하기 위하여 다 수 기술이 이용 가능 합니다. 이들은 작은 펩 티 드를 위한 수용 체 밀도3 및 미세 투 석을 위한 양전자 방출 지형과 같은 생체 내 방법을 포함 한다4. 보다 일반적으로, ex 생체 내 방법은 단백질 기능 및 발현을 검사 하는 데 사용 됩니다. 이들은 질량 분석 법5, 웨스턴 블 롯 및 효소 결합 면역 흡수 법 (ELISA)6및 면역 세포 화학 물질7을 포함 한다. 면역 세포 화학은 신경 과학 분야에서 널리 사용 됩니다. 이 기법은 관심 있는 단백질 (또는 항 원)을 검출 하는 일차 항 체를 사용 하는 것을 수반 한다 (예컨대, c-Fos) 단백질을 검출 하는 공액 2 차 항 체 복합체 (도 1). 단백질-일차 항 체-이차 항 체 복합체의 검출을 가능 하 게 하기 위해, 2 차 항 체는 그들에 게 컨 쥬 게이 션 (과산화 효소)과 사비와 같은 산화 제를 갖는다. 이것은 빛 현미경 검사 법7을 사용 하 여 검출 될 수 있는 세포에 있는 침전 물의 대형을 허용 합니다. 이차 항 체는 또한 그들에 게 콘 쥬 게이 형광 화학 물질을 가질 수 있습니다 (즉, 형광 단). 이러한 화학 물질을 자극 하는 경우,이는 단백질-일차 항 체-2 차 항 체복합체를 검출 하는데 사용 될 수 있는 빛을 방출 한다. 마지막으로, 때로는 일차 항 체가 환 원제와 형광 화학 물질이 부착 되어 이차 항 체7 의 필요성을 직접적으로 부정 합니다 (그림 1).
흥미롭게도, 많은 면역 세포 화학 법은 특정 세포 또는 뇌 영역에서 단백질의 양을 정량화 하는 능력은 아니지만 뇌 세포내에서 단백질의 시각화를 가능 하 게 합니다. 광 현미경을 사용 하 여 환 원 반응에서 침전 물을 검출 하는 것은 뉴런 및 글 리아의 시각화를 가능 하 게 하지만,이 방법은 세포 또는 특정 뇌 영역에서 단백질 발현을 정량화 하는 데 사용할 수 없습니다. 이론적으로, 형광 현미경은 형광 성 이차 항 체 로부터 방출 되는 빛이 단백질-일차 항 체-2 차 항 체 복합체의 척도 이기 때문에이를 위해 사용 될 수 있다. 그러나, 뇌 조직에서의 자동 형광은 뇌 조직8에서 단백질 발현을 정량화 하기 위해 형광 현미경을 사용 하기 어렵게 만들 수 있다. 결과적으로 뇌 조직의 형광 이미지에서 방출 되는 빛은 거의 뇌의 단백질 발현을 정량화 하는 데 사용 되지 않습니다.
이러한 문제의 대부분은 고 분해능 스캐닝9,10과 함께 근 적외선 면역 세포 화학을 사용 하 여 해결할 수 있습니다. 본 문서에서는 근 적외선 방출 스펙트럼의 형광 단에 면역 세포 화학을 결합 하 여 고 분해능 스캐닝 (예: µm)과 결합 하 여 단백질의 반 정량화를 허용 하는 선명한 이미지를 얻을 수 있는 방법을 설명 합니다. 뇌 영역.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에서 제시 된 결과는 근 적외선 면역 세포 화학이 고 분해능 스캐닝과 결합 하 여 뇌 조직에서 단백질 발현의 반 정량적 측정을 얻는 데 사용 될 수 있음을 보여준다. 또한 동일한 뇌 영역에서 동시에 두 개의 단백질을 라벨링 하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이전에 여러 뇌 영역에서 즉각적인 초기 유전자 발현을 측정 하기 위해 근 적외선 면역 조직 화학을 사용 하였다9</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 보고서에 대 한 연구는 DK에 게 부여 된 니 터 (1P20GM10363) 로부터 목표 보조금에 의해 투자 되었다.
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
References
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