げっ歯類の脳におけるタンパク質発現を測定するために近赤外蛍光と高解像度走査を用いること
Summary
ここでは、近赤外染料と免疫組織化学、高分解能走査を併用し、脳領域におけるアッセイタンパク質を測定するプロトコルを紹介します。
Abstract
神経科学は、脳内の細胞が様々な機能を媒介する方法の研究であります.ニューロンおよびグリアにおけるタンパク質発現の測定は、細胞機能が細胞タンパク質の組成および活性によって決定されるため、神経科学の研究にとって重要である。この記事では、免疫細胞化学を近赤外高解像度スキャンと組み合わせることで、異なる脳領域におけるタンパク質発現の半定量的測定値を提供する方法について説明します。この技術は、同じ脳領域内の単一または二重タンパク質発現に使用することができる。この方法でタンパク質を測定することにより、実験的操作、学習と記憶の分子シグネチャ、分子経路での活動、複数の脳領域における神経活動を伴うタンパク質発現の相対的変化を得ることができます。正しいタンパク質と統計解析を使用して、脳領域間の機能的な接続性も決定することができます。実験室で免疫細胞化学を実装する容易さを考えると、近赤外高解像度スキャンで免疫細胞化学を使用すると、神経科学者の能力を拡張して、システムレベルで神経生物学プロセスを調べることができます。
Introduction
神経科学の研究は、脳内の細胞が特定の機能1を媒介する方法の調査に関するものです。これらは、グリア細胞が中枢神経系において免疫を与える方法などの性質の細胞であるか、または背部海馬におけるニューロンの活性が空間的なナビゲーションをもたらす方法を説明することを目的とする実験を伴うことができる。広い意味では、細胞機能は、セル内で発現されているタンパク質およびこれらのタンパク質2の活性によって決定される。その結果、脳細胞におけるタンパク質の発現および/または活性の測定は、神経科学の研究にとって重要である。
脳内のタンパク質発現を測定するために、多くの技術が利用可能である。これらには、小ペプチド4の受容体密度3およびマイクロ透析のための陽電子放射地形などのインビボの方法が含まれる。より一般的には、ex vivo の方法は、タンパク質の機能および発現を検査するために使用される。これらには、質量分析技術5、ウェスタンブロットおよび酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA)6、および免疫細胞化学7が含まれる。免疫細胞化学は、神経科学の分野で広く使用されています。この技術は、一次抗体を使用して、目的のタンパク質 (または抗原) を検出する (例えば、c − Fos) および共役二次抗体がタンパク質-一次抗体複合体を検出することを含む (図 1)。タンパク質-一次抗体-二次抗体複合体の検出を可能にするために、二次抗体は、それらに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) などの酸化剤を有する。これにより、光顕微鏡7を使用して検出することができる細胞における析出物の形成を可能にする。二次抗体はまた、化学物質がそれらに共役して蛍光を発することができます (すなわち、蛍光色素)。これらの化学物質を刺激すると光が放出され、これはタンパク質-一次抗体-二次抗体複合体7を検出するために使用することができる。最後に、一次抗体は還元剤と蛍光性化学物質を結合させ、二次抗体の必要性を直接否定することがあります (図 1)。
興味深いことに、多くの免疫細胞化学方法は、脳細胞のタンパク質の可視化を可能にするが、特定の細胞または脳領域内のタンパク質の量を定量化する能力はない。還元反応からの析出物を検出するために光顕微鏡を使用することは、ニューロンおよびグリアの可視化を可能にするが、この方法は、細胞内または特定の脳領域におけるタンパク質発現を定量化するために使用することはできない。理論上、蛍光顕微鏡は、このために使用することができるが、蛍光性二次抗体から放出される光は、タンパク質−一次抗体−二次抗体複合体の尺度であるからである。しかしながら、脳組織における自己蛍光は、脳組織8におけるタンパク質発現を定量化するために蛍光顕微鏡を使用することを困難にすることができる。結果として、脳組織の蛍光画像から放出される光は、脳内のタンパク質発現を定量化するためにめったに用いられない。
これらの問題の多くは、高解像度スキャン9,10と共に近赤外免疫細胞化学を使用して対処することができます。本稿では、近赤外発光スペクトルの蛍光色素と結合した免疫細胞化学を高解像度スキャニング (例えば 10 ~ 21 μ m) と組み合わせることで、異なるタンパク質の半定量を可能にするシャープな画像を得る方法について述べる。脳領域。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、近赤外免疫細胞化学を高解像度スキャニングと組み合わせて使用することで、脳組織におけるタンパク質発現の半定量的な測定値を得ることができることを示しています。また、同じ脳領域で同時に2つのタンパク質を標識するために使用することができます.我々は以前、近赤外免疫組織化学を用いて、複数の脳領域9,10における早?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この報告書の研究は、DK に授与される NIGMS (1P20GM103653) の助成金によって賄われた。
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
References
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