Использование ближнего инфракрасного флуоресценции и высокого разрешения сканирования для измерения экспрессии белка в мозге грызунов
Summary
Здесь мы представляем протокол, который использует инфракрасные красители в сочетании с иммуногистохимии и сканирование с высоким разрешением на белки анализа в областях мозга.
Abstract
Нейробиология – это изучение того, как клетки головного мозга опосредуют различные функции. Измерение экспрессии белка в нейроне и глии имеет решающее значение для изучения нейронауки, поскольку клеточная функция определяется составом и активностью клеточных белков. В этой статье мы описываем, как иммуноцитохимия может сочетаться с сканированием с высоким разрешением в высоком разрешении, чтобы обеспечить полуколичественное измерение экспрессии белка в отдельных областях мозга. Этот метод может быть использован для одного или двойного выражения белка в том же регионе мозга. Измерение белков в этой моде может быть использовано для получения относительного изменения в экспрессии белка с экспериментальной манипуляции, молекулярные подписи обучения и памяти, активность в молекулярных путей, и нейронной активности в нескольких регионах мозга. Используя правильные белки и статистический анализ, можно также определить функциональную связь между регионами мозга. Учитывая легкость внедрения иммуноцитохимии в лабораторных условиях, использование иммуноцитохимии с инфракрасным сканированием с высоким разрешением может расширить способность нейробиолога рассматривать Нейробиологические процессы на системном уровне.
Introduction
Изучение неврологии касается исследования того, как клетки мозга опосредуют специфические функции1. Они могут быть сотовой характер, например, как глии клеток придать иммунитет в центральной нервной системе или может включать эксперименты, которые направлены, чтобы объяснить, как активность нейронов в спинной гиппокамп приводит к пространственной навигации. В широком смысле, клеточная функция определяется белками, которые выражаются в клетке и активностью этих белков2. В результате измерение экспрессии и/или активности белков в клетках головного мозга имеет решающее значение для изучения нейронауки.
Для измерения экспрессии белков в головном мозге имеется ряд методик. Они включают в себя методы естественных условиях, такие как топография выбросов Позитрон для плотности рецептора3 и микро-диализа для малых пептидов4. Чаще всего, бывшие методы в естественных условиях используются для изучения белка функции и выражения. К ним относятся методы масс-спектрометрии5, Вестерн-блот и фермент-связанный иммуноосорбентный анализ (ИФА)6и иммуноцитохимия7. Иммуноцитохимия широко используется в области неврологии. Этот метод включает в себя использование первичного антитела для обнаружения белка (или антигена) интереса (например, c-Фос) и сопряженной вторичной антитела для обнаружения белка-первичного антитела комплекса (рис. 1). Чтобы включить обнаружение белка-первичного антитела-вторичного антитела, вторичные антитела имеют окисляющие вещества, такие как пероксидазы хрена (HRP), сопряженными с ними. Это позволяет формировать осадки в клетках, которые могут быть обнаружены с помощью световой микроскопии7. Вторичные антитела могут также иметь химикаты флуорессе сопрягано к им (т.е., флюорофоры). При стимуляции эти химические вещества излучают свет, который может быть использован для обнаружения белка-первичные антитела-вторичные комплексы антител7. Последн, иногда первичные антитела имеют уменьшая вещества и химикаты флуоресценции прикрепленные к им сразу отрицая потребность для вторичных антител7 (Диаграмма 1).
Интересно, что многие методы иммуноцитохимии допускают визуализацию белков в клетках головного мозга, но не способность количественно определить количество белка в определенной клетке или области мозга. Использование световой микроскопии для обнаружения осадков от снижения реакций позволяет визуализировать нейроны и глии, но этот метод не может быть использован для количественной оценки экспрессии белка в клетках или в конкретной области мозга. В теории, Флуоресцентная микроскопия может быть использована для этого, потому что свет излучается от люминесцентного вторичного антитела измерение протеина-первичного антитела-вторичного комплекса антитела. Тем не менее, аутофлуоресценции в тканях головного мозга может сделать это трудно использовать флуоресцентной микроскопии количественно экспрессии белка в мозговой ткани8. В результате, свет, излучаемый люминесцентными изображениями мозговой ткани, редко используется для количественной оценки экспрессии белков в головном мозге.
Многие из этих вопросов могут быть решены с использованием околоинфракрасной иммуноцитохимии в сочетании с сканирования с высоким разрешением9,10. В этой статье мы описываем, как иммуноцитохимия в сочетании с флюорофорсами в спектре околоинфракрасного излучения может сочетаться с сканированием с высоким разрешением (например, 10 – 21 мкм) для получения острых изображений, позволяющих полу квантификации белка в различных областях мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Результаты, представленные в этой статье, показывают, что почти инфракрасная иммуноцитохимия в сочетании с сканированием с высоким разрешением может быть использована для получения полуколичественного измерения экспрессии белка в тканях головного мозга. Он также может быть использо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование в этом отчете финансировалось за счет целевого гранта от NIГРОССМЕЙСТЕРОВ (1P20GM103653), присужден ДК.
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
References
- Kandel, E. R. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. . From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
