Utilizzo della fluorescenza Near-Infrared e scansione ad alta risoluzione per misurare l'espressione proteica nel cervello del roditore
Summary
Qui, presentiamo un protocollo che utilizza coloranti Near-Infrared in combinazione con immunoistochimica e scansione ad alta risoluzione per analisi proteine nelle regioni cerebrali.
Abstract
La neuroscienza è lo studio di come le cellule nel cervello mediare varie funzioni. Misurare l’espressione proteica nei neuroni e nella glia è fondamentale per lo studio delle neuroscienze poiché la funzione cellulare è determinata dalla composizione e dall’attività delle proteine cellulari. In questo articolo, descriviamo come l’immunocitochimica può essere combinata con la scansione ad alta risoluzione vicino infrarosso per fornire una misura semi-quantitativa di espressione proteica in regioni cerebrali distinte. Questa tecnica può essere utilizzata per un’espressione proteica singola o doppia nella stessa regione cerebrale. La misurazione delle proteine in questo modo può essere utilizzata per ottenere un cambiamento relativo nell’espressione proteica con una manipolazione sperimentale, la firma molecolare dell’apprendimento e della memoria, l’attività nei percorsi molecolari e l’attività neurale in diverse regioni cerebrali. Utilizzando le proteine corrette e l’analisi statistica, è possibile determinare anche la connettività funzionale tra le regioni cerebrali. Data la facilità di implementazione di immunocitochimica in un laboratorio, utilizzando l’immunocitochimica con scansione ad alta risoluzione vicino infrarosso può espandere la capacità del neuroscienziato per esaminare i processi neurobiologici a livello di sistemi.
Introduction
Lo studio della neuroscienza riguarda un’indagine su come le cellule nel cervello mediano funzioni specifiche1. Questi possono essere di natura cellulare, come ad esempio il modo in cui le cellule glia conferiscono immunità nel sistema nervoso centrale o possono coinvolgere esperimenti che mirano a spiegare come l’attività dei neuroni nell’ippocampo dorsale conduce alla navigazione spaziale. In senso ampio, la funzione cellulare è determinata dalle proteine che si esprimono in una cellula e dall’attività di queste proteine2. Di conseguenza, la misurazione dell’espressione e/o dell’attività delle proteine nelle cellule cerebrali è critica per lo studio delle neuroscienze.
Una serie di tecniche sono disponibili per misurare l’espressione proteica nel cervello. Questi includono metodi in vivo come la topografia di emissione di positroni per le densità dei recettori3 e la microdialisi per i piccoli peptidi4. Più comunemente, i metodi ex vivo vengono utilizzati per esaminare la funzione e l’espressione delle proteine. Questi includono tecniche di spettrometria di massa5, Western blot e saggio immunosorbente legato all’enzima (ELISA)6e immunocitochimica7. L’immunocitochimica è ampiamente utilizzata nel campo delle neuroscienze. Questa tecnica prevede l’uso di un anticorpo primario per rilevare una proteina (o antigene) di interesse (ad esempio, c-fos) e un anticorpo secondario coniugato per rilevare il complesso di anticorpi proteina-primario (Figura 1). Per consentire il rilevamento del complesso anticorpale-anticorpo primario-derivato di proteina-primaria, gli anticorpi secondari hanno agenti ossidanti come la perossidasi di rafano (HRP) coniugato a loro. Questo permette la formazione di precipitati in cellule che possono essere rilevati utilizzando la microscopia leggera7. Gli anticorpi secondari possono anche avere prodotti chimici fluorati coniugati (cioè fluorofori). Quando stimolato queste sostanze chimiche emettono luce, che può essere utilizzato per rilevare proteina-primario anticorpo-anticorpi secondari complessi7. Infine, a volte gli anticorpi primari hanno agenti riducenti e sostanze chimiche a fluorescenza attaccate direttamente negando la necessità di anticorpi secondari7 (Figura 1).
È interessante notare che, molti metodi di immunocitochimica consentono la visualizzazione delle proteine nelle cellule cerebrali, ma non la capacità di quantificare la quantità di proteine in una regione specifica della cellula o del cervello. Utilizzando la microscopia leggera per rilevare i precipitati dalle reazioni di riduzione consente la visualizzazione di neuroni e glia, ma questo metodo non può essere utilizzato per quantificare l’espressione proteica nelle cellule o in una specifica regione del cervello. In teoria, la microscopia a fluorescenza può essere utilizzata per questo, perché la luce emessa dall’anticorpo secondario fluorescente è una misura del complesso anticorpale-anticorpo primario-secondario proteina-primaria. Tuttavia, l’autofluorescenza nel tessuto cerebrale può rendere difficile l’uso della microscopia a fluorescenza per quantificare l’espressione proteica nel tessuto cerebrale8. Di conseguenza, la luce emessa dalle immagini fluorescenti del tessuto cerebrale è raramente utilizzata per quantificare l’espressione proteica nel cervello.
Molti di questi problemi possono essere affrontati utilizzando immunocitochimica Near-Infrared in combinazione con scansione ad alta risoluzione9,10. In questo articolo descriviamo come l’immunocitochimica accoppiata con i fluorofori negli spettri di emissione Near-Infrared può essere combinata con la scansione ad alta risoluzione (ad esempio, 10 – 21 μm) per ottenere immagini nitide che consentano la semi quantificazione delle proteine in distinte regioni cerebrali.
Protocol
Representative Results
Discussion
I risultati presentati in questo articolo dimostrano che l’immunocitochimica vicino all’infrarosso in combinazione con la scansione ad alta risoluzione può essere utilizzata per ottenere misure semi-quantitative dell’espressione proteica nel tessuto cerebrale. Può anche essere usato per etichettare due proteine contemporaneamente nella stessa regione del cervello. In precedenza abbiamo usato immunoistochimica vicino all’infrarosso per misurare l’immediata espressione genica precoce in più regioni cerebrali<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca in questo rapporto è stata finanziata da una sovvenzione bersaglio dai NIGMS (1P20GM103653) assegnato a DK.
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
References
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