Kemirgen beyninde protein Ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanma
Summary
Burada, İmmünohistokimya ve yüksek çözünürlüklü beyin bölgelerinin proteinleri için tarama ile birlikte yakın kızılötesi boyalar kullanan bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Nörobilim, beyindeki hücrelerin çeşitli fonksiyonları nasıl Arabulmaya çalışışıdır. Hücresel fonksiyon hücre proteinlerinin bileşimi ve aktivitesi ile belirlendiği için nöronlar ve glia ‘da protein ifadesinin ölçülmesi Nörobilim çalışması için önemlidir. Bu yazıda, immünosittokimya ‘nın farklı beyin bölgelerinde yarı niceliksel bir protein ifadesi sağlamak için yakın kızılötesi yüksek çözünürlüklü taramayla nasıl birleştirildiğini açıklayacağız. Bu teknik aynı beyin bölgesinde tek veya çift protein ifadesi için kullanılabilir. Bu moda proteinleri ölçme deneysel manipülasyon ile protein ifadesinde göreceli bir değişiklik elde etmek için kullanılabilir, öğrenme ve bellek moleküler imza, moleküler yollardan aktivite, ve birden fazla beyin bölgelerinde nöral aktivite. Doğru proteinleri ve istatistiksel analizi kullanarak, beyin bölgeleri arasında fonksiyonel bağlantı da tespit edilebilir. İmmünosittokimya bir laboratuvarda uygulama kolaylığı göz önüne alındığında, yakın kızılötesi yüksek çözünürlüklü tarama ile immünsitokimya kullanarak bir sistem düzeyinde nörobiyolojik süreçleri incelemek için Nörobilim yeteneği genişletebilirsiniz.
Introduction
Nörobilim çalışma beyin hücrelerin belirli fonksiyonları aracı nasıl bir soruşturma endişeleri1. Bu nasıl glia hücrelerinin merkezi sinir sisteminde dokunulmazlık görüşmek gibi doğada hücresel olabilir ya da dorsal hipokampus nöronların aktivitesinin mekansal navigasyon neden açıklamak amacı deneyler içerebilir. Geniş anlamda, hücresel fonksiyon, bir hücrede ifade edilen proteinler ve bu proteinlerin aktivitesi2ile belirlenir. Sonuç olarak, beyin hücrelerinde proteinlerin ifade ve/veya etkinliğini ölçmek Nörobilim çalışması için önemlidir.
Beyindeki protein ifadesini ölçmek için bir dizi teknik mevcuttur. Bu reseptör yoğunlukları için pozitron emisyon topografyası gibi in vivo yöntemleri içerir3 ve küçük peptitler için mikro-diyaliz4. Daha sık, ex vivo yöntemleri protein fonksiyonu ve ifade incelemek için kullanılır. Bunlar arasında kütle spektrometresi teknikleri5, Batı leke ve enzim bağlantılı İmmünosorbent tahlil (ELISA)6ve immünositokimya7yer aldı. İmmünositokimya Nörobilim alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu teknik, bir protein (veya antijen) ilgi (örn., c-fos) ve proteinli primer antikor kompleksi (Şekil 1) tespit etmek için konjonk ikincil antikor algılamak için birincil antikor kullanımını içerir. Protein-primer antikor-ikincil antikor kompleksinin algılanmasını sağlamak için, ikincil antikorlar, onlara konjuze edilen horserpu peroksidaz (HRP) gibi maddelere oksitleyici sahiptir. Bu ışık mikroskobu7kullanılarak tespit edilebilir hücrelerde çökeller oluşumu için izin verir. İkincil antikorlar da onlara (yani, fluorophores) conjuated kimyasallar floresan olabilir. Ne zaman bu kimyasallar uyarıcı protein-primer antikor-ikincil antikor kompleksleri7algılamak için kullanılabilir ışık, yayar. Son olarak, bazen primer antikorlar azalan ajanlar ve floresan kimyasallara bağlı olarak ikincil antikorlara olan ihtiyacını doğrudan ihmal ediyorlar7 (Şekil 1).
İlginçtir, birçok immünosittokimya yöntemleri beyin hücrelerinde proteinlerin görselleştirme için izin, ancak belirli bir hücre veya beyin bölgesinde protein miktarını ölçmek için yeteneği. Azaltma reaksiyonlarının çökmesini algılamak için ışık mikroskobu kullanarak nöronların ve glia görselleştirme için izin verir, ancak bu yöntem hücrelerde veya belirli bir beyin bölgesinde protein ifadesi ölçmek için kullanılamaz. Teorik olarak, fluoresan mikroskobu için kullanılabilir, çünkü floresan ikincil antikor yayılan ışık protein-primer antikor-ikincil antikor kompleksi bir ölçüsüdür. Ancak, beyin dokusunda otofloresans, beyin dokusunda protein ifadesini ölçmek için Floresan Mikroskobu kullanmak zor yapabilir8. Sonuç olarak, beyin dokusu floresan görüntülerden yayılan ışık nadiren beyinde protein ifadesi ölçmek için kullanılır.
Bu konuların çoğu yüksek çözünürlüklü tarama9,10ile birlikte yakın kızılötesi immünosittokimya kullanılarak ele alınabilir. Bu yazıda, yakın kızılötesi emisyon spektrumunda fluorophores ile birleşen immünositozin, yüksek çözünürlüklü tarama (örneğin, 10 – 21 μm) ile birleştirilip farklı beyin bölgeleri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede sunulan sonuçlar, yüksek çözünürlüklü tarama ile birlikte yakın kızılötesi immünsitokimya beyin dokusunda protein ifadesi yarı niceliksel önlemler elde etmek için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Aynı beyin bölgesinde aynı anda iki proteini etiketlemek için de kullanılabilir. Daha önce birden fazla beyin bölgelerinde hemen erken gen ifadesi ölçmek için yakın kızılötesi immünhistokimya kullandık9,10. Hemen erke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu raporda yapılan araştırmalar, NIGMS ‘den (1P20GM103653) DK ‘ya verilen bir hedef hibe tarafından finanse edildi.
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
References
- Kandel, E. R. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. . From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
