कृंतक मस्तिष्क में प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए लगभग अवरक्त प्रतिदीप्ति और उच्च संकल्प स्कैनिंग का उपयोग करना
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि immunohistoरसायनशास्त्र और उच्च संकल्प के साथ संयोजन के रूप में अवरक्त रंगों का उपयोग करता है मस्तिष्क क्षेत्रों में परख प्रोटीन स्कैनिंग प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
तंत्रिका विज्ञान का अध्ययन है कि कैसे मस्तिष्क में कोशिकाओं के विभिंन कार्यों मध्यस्थता । ंयूरॉंस और गलिया में प्रोटीन अभिव्यक्ति मापने तंत्रिका विज्ञान के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में सेलुलर समारोह संरचना और सेलुलर प्रोटीन की गतिविधि द्वारा निर्धारित होता है । इस अनुच्छेद में, हम का वर्णन कैसे immunocytochemistry पास के साथ संयुक्त किया जा सकता है अवरक्त उच्च-विभेदन के लिए अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक अर्द्ध मात्रात्मक उपाय प्रदान स्कैनिंग । इसी ब्रेन रीजन में सिंगल या डबल प्रोटीन एक्सप्रेशन के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया जा सकता है । इस फैशन में प्रोटीन को मापने के लिए एक प्रयोगात्मक हेरफेर, सीखने और स्मृति के आणविक हस्ताक्षर, आणविक रास्ते में गतिविधि, और कई मस्तिष्क क्षेत्रों में तंत्रिका गतिविधि के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति में एक सापेक्ष परिवर्तन प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सही प्रोटीन और सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग करना, मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी के रूप में अच्छी तरह से निर्धारित किया जा सकता है । एक प्रयोगशाला में immunocytochemistry को लागू करने की आसानी को देखते हुए, निकट अवरक्त उच्च संकल्प स्कैनिंग के साथ इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग न्यूरोसाइंटिस्ट की क्षमता का विस्तार कर सकते हैं एक सिस्टम स्तर पर न्यूरोलॉजिकल प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए.
Introduction
तंत्रिका विज्ञान के अध्ययन के एक जांच की चिंताओं मस्तिष्क में कोशिकाओं को कैसे विशिष्ट कार्यों के माध्यम से मध्यस्थता1. इन प्रकृति में सेलुलर किया जा सकता है जैसे कैसे गलिया कोशिकाओं केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में प्रतिरक्षा प्रदान या प्रयोगों है कि उद्देश्य समझाने के लिए कैसे पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में ंयूरॉंस की गतिविधि स्थानिक नेविगेशन के लिए सुराग शामिल कर सकते हैं । एक व्यापक अर्थों में, सेलुलर समारोह प्रोटीन है कि एक सेल में व्यक्त कर रहे हैं और इन प्रोटीन की गतिविधि द्वारा निर्धारित किया जाता है2. नतीजतन, मस्तिष्क की कोशिकाओं में अभिव्यक्ति और/या प्रोटीन की गतिविधि को मापने तंत्रिका विज्ञान के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं ।
ब्रेन में प्रोटीन एक्सप्रेशन को मापने के लिए कई तकनीकें उपलब्ध हैं । इन vivo विधियों जैसे रिसेप्टर घनत्व3 और छोटे पेप्टाइड4के लिए माइक्रो डायलिसिस के लिए पोजिट्रॉन उत्सर्जन स्थलाकृति के रूप में शामिल हैं । अधिक सामांयतः, पूर्व vivo तरीकों प्रोटीन समारोह और अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है । इनमें मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक5, वेस्टर्न ब्लॉट और एंजाइम से जुड़ी इम्यूनोसोतुला परख (एलिसा)6और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री7शामिल हैं । इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री व्यापक रूप से तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है । इस तकनीक में एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए एक प्रोटीन (या प्रतिजन) ब्याज का पता लगाने के लिए शामिल है (जैसे, सी-Fos) और प्रोटीन प्राथमिक एंटीबॉडी परिसर का पता लगाने के लिए एक संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (चित्रा 1). प्रोटीन प्राथमिक एंटीबॉडी-माध्यमिक एंटीबॉडी जटिल का पता लगाने को सक्षम करने के लिए, द्वितीयक एंटीबॉडी ऐसे सहिजन peroxidase (HRP) के रूप में उन से संयुग्मित एजेंटों ऑक्सीकरण हो गया है । यह कोशिकाओं है कि प्रकाश माइक्रोस्कोपी7का उपयोग कर पता लगाया जा सकता में precipitates के गठन के लिए अनुमति देता है । द्वितीयक एंटीबॉडी भी रसायन fluoresce उन्हें करने के लिए संयुग्मित हो सकता है (यानी, fluorophores). जब उत्तेजित इन रसायनों प्रकाश, जो प्रोटीन प्राथमिक एंटीबॉडी-माध्यमिक एंटीबॉडी परिसरों7का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता फेंकना । अंत में, कई बार प्राथमिक एंटीबॉडी एजेंटों और प्रतिदीप्ति रसायनों को कम करने के लिए उन से जुड़े सीधे माध्यमिक एंटीबॉडी7 के लिए की जरूरत नकार है (चित्रा 1).
दिलचस्प है, कई इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री तरीकों मस्तिष्क की कोशिकाओं में प्रोटीन के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन एक विशिष्ट कोशिका या मस्तिष्क क्षेत्र में प्रोटीन की मात्रा को निर्धारित करने की क्षमता नहीं है । कम प्रतिक्रियाओं से precipitates का पता लगाने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग ंयूरॉंस और glia के दृश्य के लिए अनुमति देता है, लेकिन इस विधि कोशिकाओं में या एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र में प्रोटीन अभिव्यक्ति बताना करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । सिद्धांत रूप में, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी से उत्सर्जित प्रकाश प्रोटीन प्राथमिक एंटीबॉडी-माध्यमिक एंटीबॉडी परिसर का एक उपाय है । हालांकि, मस्तिष्क के ऊतकों में ऑटोफ्लोरेसेंस8मस्तिष्क के ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना मुश्किल बना सकता है । नतीजतन, मस्तिष्क ऊतक के फ्लोरोसेंट छवियों से उत्सर्जित प्रकाश शायद ही कभी मस्तिष्क में प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा का उपयोग किया जाता है ।
इन मुद्दों के कई उच्च संकल्प स्कैनिंग9,10के साथ संयोजन के रूप में पास अवरक्त immunocytochemistry का उपयोग कर संबोधित किया जा सकता है । इस अनुच्छेद में, हम का वर्णन कैसे immunocytochemistry निकट अवरक्त उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में fluorophores के साथ युग्मित उच्च संकल्प स्कैनिंग के साथ संयुक्त किया जा सकता है (जैसे, 10 – 21 μm) तेज छवियों कि अलग में प्रोटीन की अर्द्ध प्रमात्रीकरण के लिए अनुमति प्राप्त करने के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में प्रस्तुत परिणामों से पता चलता है कि उच्च संकल्प स्कैनिंग के साथ संयोजन में के पास अवरक्त immunocytochemistry के अर्द्ध मस्तिष्क के ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रात्मक उपाय प्राप्त करने के लिए इस…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस रिपोर्ट में अनुसंधान का वित्तपोषण डीके को दिए गए एनआईजीएमएस (1P20GM103653) से लक्षित अनुदान द्वारा किया गया था ।
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
References
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