Använda Near-infraröd Fluorescence och hög upplöst skanning för att mäta protein uttryck i gnagare Brain

Summary

Här presenterar vi ett protokoll som använder nära-infraröda färg ämnen i samband med immunhistokemi och hög upplöst skanning för att assay proteiner i hjärnans regioner.

Abstract

Neurovetenskap är studiet av hur celler i hjärnan förmedlar olika funktioner. Att mäta protein uttryck i nerv celler och glia är avgörande för studiet av neurovetenskap eftersom cellulär funktion bestäms av cell proteiners sammansättning och aktivitet. I den här artikeln beskriver vi hur immunocytokemi kan kombineras med nära infraröd hög upplöst skanning för att ge ett semikvantitativt mått av protein uttryck i olika hjärn regioner. Denna teknik kan användas för enkel eller dubbel protein uttryck i samma hjärn region. Att mäta proteiner på detta sätt kan användas för att få en relativ förändring i protein uttryck med en experimentell manipulation, molekylär signatur av inlärning och minne, aktivitet i molekyl ära vägar och neurala aktiviteter i flera hjärn regioner. Med hjälp av rätt proteiner och statistisk analys kan funktionell anslutning mellan hjärn regioner också bestämmas. Med tanke på enkelheten att implementera immuncytokemi i ett laboratorium, med hjälp av immuncytochemistry med nära infraröd hög upplöst scanning kan utöka förmågan hos neuroforskaren att undersöka neurobiologiska processer på system nivå.

Introduction

Studien av neurovetenskap angår en utredning av hur celler i hjärnan förmedlar specifika funktioner¹. Dessa kan vara cellulära i naturen såsom hur glia celler ge immunitet i det centrala nerv systemet eller kan innebära experiment som syftar till att förklara hur aktiviteten av nerv celler i dorsala Hippocampus leder till geografisk navigering. I vid bemärkelse bestäms cellulär funktion av de proteiner som uttrycks i en cell och aktiviteten hos dessa proteiner². Som ett resultat, att mäta uttryck och/eller aktivitet av proteiner i hjärn celler är avgörande för studiet av neurovetenskap.

Ett antal tekniker finns tillgängliga för att mäta protein uttryck i hjärnan. Dessa inkluderar in vivo metoder såsom positron emission topografi för receptor tätheter³ och mikro-dialys för små peptider⁴. Mer allmänt används ex vivo-metoder för att undersöka proteiners funktion och uttryck. Dessa inkluderar masspektrometri tekniker⁵, Western blot och enzymlänkade immunosorbent ASSAY (Elisa)⁶, och immuncytochemistry⁷. Immunocytokemi används i stor utsträckning inom neurovetenskap. Denna teknik innebär användning av en primär anti kropp för att detektera ett protein (eller antigen) av intresse (t. ex. c-FOS) och en konjugerad sekundär anti kropp för att detektera det protein primära anti kropps komplexet (figur 1). För att möjliggöra detektion av protein-primära anti kropps-sekundära anti kropp komplex, sekundära anti kroppar har oxiderande ämnen såsom pepparrotperoxidas (HRP) konjugerat till dem. Detta möjliggör bildandet av fälltates i celler som kan detekteras med hjälp av ljusmikroskopi⁷. Sekundära anti kroppar kan också ha kemikalier fluorescerar i konjugerade till dem (dvs. fluorophores). När stimuleras dessa kemikalier avger ljus, som kan användas för att upptäcka protein-primära anti kropp-sekundära anti kropps komplex⁷. Slutligen, ibland primära anti kroppar har reducerande medel och fluorescens kemikalier knutna till dem direkt förneka behovet av sekundära anti kroppar⁷ (figur 1).

Intressant, många immuncytochemistry metoder möjliggör visualisering av proteiner i hjärn celler, men inte förmågan att kvantifiera mängden protein i en specifik cell eller hjärn region. Med hjälp av ljusmikroskopi för att detektera fällning från Reduktions reaktioner möjliggör visualisering av nerv celler och glia, men denna metod kan inte användas för att kvantifiera protein uttryck i celler eller i en specifik hjärn region. I teorin kan fluorescensmikroskopi användas för detta, eftersom det ljus som avges från den fluorescerande sekundära anti kroppen är ett mått på det protein primära anti kropps-sekundära anti kropps komplexet. Emellertid, autofluorescence i hjärn vävnad kan göra det svårt att använda fluorescens mikroskopi att kvantifiera protein uttryck i hjärn vävnad⁸. Som ett resultat, ljus avges från fluorescerande bilder av hjärn vävnad används sällan för att kvantifiera protein uttryck i hjärnan.

Många av dessa problem kan åtgärdas med hjälp av nära-infraröd immuncytokemi i samband med hög upplöst skanning^9,10. I den här artikeln beskriver vi hur immuncytokemi i kombination med fluorophores i de nära infraröda emissions spektra kan kombineras med hög upplöst skanning (t. ex. 10 – 21 μm) för att få skarpa bilder som möjliggör semikvantifiering av protein i olika regioner i hjärnan.

Protocol

Följande protokoll godkändes av den institutionella djur omsorgs-och användnings kommittén (IACUC) vid University of Delaware. Male Sprague Dawley råttor ungefär 55-75 dagar gammal användes för detta protokoll. 1. Brain extraktion och vävnads beredning Anesthetize råtta med isofluran i anestesi induktions kammare tills råtta inte längre uppvisar ett svar på foten nypa. Offra råttor via snabb hals hals huggning med hjälp av en giljotin. Skär huden p…

Representative Results

Innan man använder hög upplöst skanning för immunhistokemi bör man kontrol lera att protokollet fungerar. Detta kan åstadkommas med hjälp av ett validerings test där hjärn avsnitt från samma djur inkuberas med primära och sekundära anti kroppar, sekundär anti kropp ensam, eller varken primär eller sekundär anti kropp. Resultaten för en sådan validerings analys visas i figur 2. I denna reaktion var vi upptäcka den omedelbara tidiga genen c-ju…

Discussion

De resultat som presenteras i denna artikel visar att nära-infraröd immuncytokemi i kombination med hög upplöst scanning kan användas för att få semi-kvantitativa mått av protein uttryck i hjärn vävnad. Det kan också användas för att märka två proteiner samtidigt i samma hjärn region. Vi har tidigare använt närinfraröd immunohistokemi för att mäta omedelbart tidigt gen uttryck i flera hjärn regioner^9,10. Omedelbara tidiga gener kan användas…

Materials

Brain Extraction
Anesthesia Induction Chamber	Kent Scientific	VetFlo-0530SM
Kleine Guillotine	Harvard Apparatus	73-1920
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14	used to remove back of skull
Delicate Dissecting Scissors	Fischer Scientific	08-951-5	used to cut upward along midline of skull
Micro Spatula	Fischer Scientific	21-401-5	used to scoop out brain
Glass Microscope Slides	Fischer Scientific	12-549-6
Immunohistochemical Reaction
Triton X-100			Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody
Tween-20			Used as a small amount of detergent added to TBS  to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody
Licor Odyssey scanner	Licor Biotechnology Inc.
Image Studio	Licor Biotechnology Inc.