Modification du génome de Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated pour l'étude des cellules hématopoïétiques dans les modèles de maladie
Summary
Les protocoles décrits pour l’édition génomique très efficace des cellules hématopoïétiques et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) par le système CRISPR/Cas9 pour développer rapidement des systèmes de modèle de souris avec des modifications génétiques hématopoïétiques spécifiques au système.
Abstract
La manipulation des gènes dans les cellules souches hématopoïétiques à l’aide d’approches transgenèses conventionnelles peut prendre beaucoup de temps, être coûteuse et difficile. Bénéficiant des progrès de la technologie d’édition du génome et des systèmes d’administration de transgènes médiés par lentivirus, une méthode efficace et économique est décrite ici qui établit des souris dans lesquelles les gènes sont manipulés spécifiquement dans les cellules souches hématopoïétiques. Les lentivirus sont utilisés pour transduire les cellules de moelle osseuse cas9-exprimant esfilées par lignée avec un ARN guide (gRNA) ciblant des gènes spécifiques et un gène de reporter de fluorescence rouge (RP), puis ces cellules sont transplantées dans des souris C57BL/6 mortellement irradiées. Les souris transplantées avec le lentivirus exprimant le gRNA non-ciblage sont employées comme contrôles. L’engraftment des cellules souches hématopoïétiques transducées sont évalués par l’analyse cytométrique de flux des leucocytes RFP-positifs du sang périphérique. En utilisant cette méthode, la transduction de 90 % des cellules myéloïdes et 70 % des cellules lymphoïdes à 4 semaines après la transplantation peuvent être réalisées. L’ADN génomique est isolé des cellules sanguines RFP-positives, et des parties de l’ADN du site ciblé sont amplifiées par PCR pour valider l’édition du génome. Ce protocole fournit une évaluation à haut débit des gènes hématopoiesis-régulateurs et peut être étendu à une série de modèles de maladie de souris avec la participation hématopoietic de cellules.
Introduction
Beaucoup d’études en hématologie et immunologie s’appuient sur la disponibilité de souris génétiquement modifiées, y compris les souris transgéniques/knock-out conventionnelles et conditionnelles qui utilisent des pilotes de Cre hématopoïétiques spécifiques au système tels que Mx1-Cre, Vav-Cre, et d’autres 1,2,3,4,5. Ces stratégies exigent l’établissement de nouvelles souches de souris, qui peuvent prendre beaucoup de temps et être financièrement lourdes. Alors que les progrès révolutionnaires dans la technologie d’édition du génome ont permis la génération de nouvelles souches de souris en aussi peu que 3-4 mois avec l’expertise technique appropriée6,7,8,9 , beaucoup plus de temps est nécessaire pour amplifier la colonie de souris avant que les expériences soient poursuivies. De plus, ces procédures sont coûteuses. Par exemple, Jackson Laboratory énumère le prix actuel des services de génération de souris knock-out à 16 845 $ par souche (en décembre 2018). Ainsi, les méthodes qui sont plus économiques et efficaces que les approches transgéniques murine sinais classiques sont plus avantageuses.
La technologie des protéines 9 (CRISPR/Cas9) associées à des répétitions palindromic courtes et interspatiales a conduit au développement de nouveaux outils pour une édition rapide et efficace du génome à base d’ARN et spécifique à la séquence. Découvert à l’origine comme mécanisme immunitaire adaptatif bactérien pour détruire l’ADN pathogène envahissant, le système CRISPR/Cas9 a été utilisé comme un outil pour augmenter l’efficacité de l’édition du génome dans les cellules eucaryotes et les modèles animaux. Un certain nombre d’approches ont été utilisées pour transmettre des machines CRISPR/Cas9 dans les cellules souches hématopoïétiques (c.-à-d. électropoction, nucléofection, lipofection, livraison virale, et d’autres).
Ici, un système de lentivirus est employé pour transduire des cellules en raison de sa capacité à infecter effectivement Cas9-exprimant les cellules souches hématopoïétiques murines et emballent ensemble la construction d’expression d’ARN de guide, les promoteurs, les séquences réglementaires, et les gènes qui codent protéines fluorescentes de journaliste (c.-à-d., GFP, DP). En utilisant cette méthode, l’édition de gènes ex vivo des cellules souches hématopoïétiques de souris a été réalisée, suivie d’une reconstitution réussie de la moelle osseuse chez des souris mortellement irradiées10. Le vecteur de lentivirus utilisé pour cette étude exprime les gènes de journaliste Cas9 et GFP du promoteur commun de noyau EF1a avec un site d’entrée ribosomal interne en amont du gène de journaliste. La séquence d’ARN guide est exprimée à partir d’un promoteur U6 séparé. Ce système est ensuite utilisé pour créer des mutations d’insertion et de suppression dans les gènes de pilote d’hématopoiesis clonal candidat Tet2 et Dnmt3a10. Cependant, l’efficacité de la transduction par cette méthode est relativement faible (-5%-10%) en raison de la grande taille de l’insert vectoriel (13 Kbp) qui limite l’efficacité de la transduction et réduit le taquet de virus pendant la production.
Dans d’autres études, il a été démontré que la taille plus importante de l’ARN viral affecte négativement à la fois la production de virus et l’efficacité de la transduction. Par exemple, une augmentation de 1 kb de la taille de l’insert est signalée pour diminuer la production de virus de 50%, et l’efficacité de la transduction diminuera à plus de 50% dans les cellules souches hématopoïétiques de souris11. Ainsi, il est avantageux de réduire la taille de l’insert viral autant que possible pour améliorer l’efficacité du système.
Cette lacune peut être surmontée en employant des souris transgéniques Cas9, dans lesquelles la protéine Cas9 s’exprime d’une manière constitutive ou inductible12. Les souris constitutives CRISPR/Cas9 se heurtent à l’endodocléase Cas9 et à l’EGFP du promoteur du CAG au locus Rosa26 d’une manière omniprésente. Ainsi, une construction avec sgRNA sous le contrôle du promoteur U6 et du gène journaliste de La DP sous le contrôle du promoteur DE base EF1a peut être livrée à l’aide du vecteur de lentivirus pour réaliser l’édition du génome. Avec ce système, les gènes des cellules souches hématopoïétiques ont été modifiés avec succès, montrant une efficacité de transduction de 90%. Ainsi, ce protocole fournit une méthode rapide et efficace pour créer des souris dans lesquelles des mutations génétiques ciblées sont introduites dans le système hématopoïétique. Alors que notre laboratoire utilise principalement ce type de technologie pour étudier le rôle de l’hématopoiesis clonal dans les processus de maladies cardiovasculaires13,14,15, il est également applicable aux études de l’hématologie malignité16. En outre, ce protocole peut être étendu à l’analyse de la façon dont les mutations de l’ADN dans HSPC impact d’autres maladies ou des processus de développement dans le système hématopoïétique.
Pour établir un système vectoriel de lentivirus robuste, des stocks viraux élevés de titer et des conditions optimisées pour la transduction et la transplantation des cellules hématopoïétiques sont exigés. Dans le protocole, des instructions sont fournies sur la préparation d’un stock viral de haute titer dans la section 1, l’optimisation des conditions de culture des cellules souches hématopoïétiques murines dans la section 2, les méthodes de transplantation de moelle osseuse dans la section 3, et l’évaluation l’engraftment dans la section 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’avantage de ce protocole est la création de modèles animaux abritant des mutations spécifiques dans les cellules hématopoïétiques d’une manière rapide et très rentable par rapport aux approches transgéniques classiques de souris. Il a été constaté que cette méthodologie permet la génération de souris avec des cellules hématopoïétiques gènes-manipulations dans un délai de 1 mois. Il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole qui nécessitent un examen plus approfondi.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. S. a été soutenu par une bourse postdoctorale de l’American Heart Association 17POST33670076. K. W. a reçu l’appui des NIH pour les subventions R01 HL138014, R01 HL141256 et R01 HL139819.
Materials
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216– | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
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