疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集
Summary
CRISPR/Cas9システムによるマウス造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の高効率ゲノム編集のためのプロトコルは、造血系特異的遺伝子改変を用いたマウスモデルシステムを迅速に開発する。
Abstract
従来のトランスジェネシスアプローチを使用して造血幹細胞の遺伝子を操作することは、時間がかかり、コストがかかり、困難な場合があります。ゲノム編集技術とレンチウイルス媒介トランスジーン送達システムの進歩の恩恵を受け、造血幹細胞で遺伝子が特異的に操作されるマウスを確立する効率的かつ経済的な方法がここに記載されています。レンチウイルスは、特定の遺伝子と赤色蛍光レポーター遺伝子(RFP)を標的とするガイドRNA(gRNA)を用いてCas9発現系統陰性骨髄細胞をトランスデュースするために使用され、次いでこれらの細胞を致死照照照射C57BL/6マウスに移植する。非標的gRNAを発現するレンチウイルスで移植されたマウスは、対照として使用される。トランスプリエド造血幹細胞の移植は、末梢血のRFP陽性白血病のフローサイトメトリック解析により評価される。この方法を用いて、移植後4週間でミエロイド細胞の約90%、リンパ球細胞の約70%のトランスダクションを達成することができる。ゲノムDNAはRFP陽性血液細胞から単離され、標的部位DNAの一部をPCRによって増幅してゲノム編集を検証します。このプロトコルは、血化調節遺伝子のハイスループット評価を提供し、血化細胞関与を有する様々なマウス疾患モデルに拡張することができる。
Introduction
血液学と免疫学の多くの研究は、Mx1-Cre、Vav-Creなどの血液系特異的なCreドライバを利用する従来および条件付きトランスジェニック/ノックアウトマウスを含む遺伝子組み換えマウスの利用可能性に依存しています。1,2,3,4,5.これらの戦略は、時間がかかり、財政的負担になる可能性があり、新しいマウス株の確立を必要とします。ゲノム編集技術の革命的な進歩は、適切な技術的専門知識6、7、8、9とわずか3〜4ヶ月で新しいマウス株の生成を可能にしました、実験を追求する前にマウスのコロニーを増幅するためにはるかに多くの時間が必要です。さらに、これらの手順はコストがかかります。例えば、ジャクソン研究所は、ノックアウトマウス生成サービスの現在の価格を1株当たり16,845ドル(2018年12月現在)でリストしています。したがって、従来のマウストランスジェニックアプローチよりも経済的かつ効率的な方法がより有利である。
クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピート/CRISPR関連タンパク質9(CRISPR/Cas9)技術は、迅速かつ効率的なRNAベースの配列特異的ゲノム編集のための新しいツールの開発につながっています。もともと侵入病原体DNAを破壊する細菌適応免疫機構として発見されたCRISPR/Cas9システムは、真核細胞および動物モデルにおけるゲノム編集の有効性を高めるためのツールとして使用されてきた。CRISPR/Cas9機械を造血幹細胞(例えば、エレクトロポレーション、核産生、脂肪減少、ウイルス送達など)に送達するアプローチが数多く採用されています。
ここでは、Cas9発現マウス造血幹細胞に効果的に感染し、ガイドRNA発現構造、プロモーター、調節配列、およびコードする遺伝子を一緒にパッケージ化する能力のために細胞をトランスデュースするためにレンチウイルスシステムが採用されています。蛍光レポータータンパク質(すなわち、GFP、RFP)。この方法を用いて、マウス造血幹細胞のex vivo遺伝子編集が達成され、続いて致死的に照射されたマウス10における骨髄の再構成に成功した。本研究に用いられるレンチウイルスベクターは、レポーター遺伝子から上流に上流の内部リボソーム入口部位を持つ共通コアEF1aプロモーターからのCas9およびGFPレポーター遺伝子を発現する。ガイドRNA配列は、別個のU6プロモーターから発現される。このシステムは、次いで、候補クローン無毛症ドライバ遺伝子Tet2およびDnmt3a10における挿入および欠失変異を作成するために使用される。しかし、この方法による経流効率は比較的低い(~5%-10%)。伝達効率を制限し、生産中にウイルス力を減少させるベクター挿入物(13 Kbp)の大きさのために。
他の研究では、より大きなウイルスRNAサイズがウイルス産生とトランスダクション効率の両方に悪影響を及ぼすことが示されている。例えば、挿入サイズの1kbの増加は、ウイルス産生を〜50%減少させることが報告され、および経転移効率はマウス造血幹細胞11において50%以上に減少する。したがって、システムの効率を向上させるためにウイルスインサートのサイズを可能な限り小さくすることが有利である。
この欠点は、Cas9トランスジェニックマウスを採用することによって克服することができ、Cas9タンパク質は構成的または誘導可能な方法12のいずれかで発現される。構成的なCRISPR/Cas9ノックインマウスは、ローザ26遺伝子座のCAGプロモーターからCas9エンドヌクレアーゼおよびEGFPをユビキタスな方法で発現する。これにより、コアEF1aプロモーターの制御下にあるU6プロモーターおよびRFPレポーター遺伝子の制御下でsgRNAを用いて構築し、レンチウイルスベクターを用いてゲノム編集を達成することができる。このシステムにより、造血幹細胞の遺伝子の編集に成功し、約90%の経流効率を示しました。したがって、このプロトコルは、標的遺伝子変異が人工系に導入されるマウスを迅速かつ効果的に作成する方法を提供する。私たちの研究室は、主に心血管疾患プロセス13、14、15におけるクローンヘマチオピスの役割を研究するために、このタイプの技術を使用していますが、それはまた、血液学の研究に適用可能です悪性腫瘍16.さらに、このプロトコルは、HSPCにおけるDNA突然変異が、人工システムにおける他の疾患または発達過程にどのように影響するかの分析に拡張することができる。
堅牢なレンチウイルスベクターシステムを確立するためには、高価気力ウイルスストックと血行細胞の移植および移植のための最適化された条件が必要とされる。プロトコルでは、セクション1の高チテーターウイルスストックの調製に関する指示が提供され、セクション2におけるマウス造血幹細胞の培養条件を最適化し、セクション3における骨髄移植の方法、および評価を行う。セクション4の移植。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの利点は、従来のマウストランスジェニックアプローチと比較して、迅速かつ非常に費用対効果の高い方法で血化細胞の特定の変異を収容する動物モデルの作成です。この方法論により、造血細胞遺伝子操作を1ヶ月以内にマウスの生成が可能となることがわかった。このプロトコルには、さらに検討が必要な重要な手順がいくつかあります。
gRNA配?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.S.は、アメリカ心臓協会のポスドク・フェローシップ17POST33670076によって支援されました。K. W. は、NIH 助成金 R01 HL138014、R01 HL141256、および R01 HL139819 によってサポートされました。
Materials
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216– | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
References
- Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
- Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
- Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
- Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9 (312), (2016).
- Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
- Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
- Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
- Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
- Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
- Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. , (2018).
