질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집
Summary
설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.
Abstract
기존의 종족 형성 접근법을 사용하여 조혈 줄기 세포에서 유전자를 조작하는 것은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 도전적일 수 있습니다. 게놈 편집 기술 및 렌티바이러스 매개 이식 유전자 전달 시스템의 발전으로부터 이익을 얻는 효율적이고 경제적인 방법은 조혈 줄기 세포에서 유전자가 특별히 조작되는 마우스를 확립하는 데 설명되어 있습니다. 렌티바이러스는 Cas9 발현 계보 음성 골수 세포를 특정 유전자 및 적색 형광 리포터 유전자(RFP)를 표적으로 하는 가이드 RNA(gRNA)로 트랜스듀싱한 다음, 이들 세포는 Lethally-조사된 C57BL/6 마우스로 이식됩니다. 비표적GRNA를 발현하는 렌티바이러스로 이식된 마우스는 대조군으로 사용된다. 형질전환된 조혈 줄기 세포의 생착은 말초 혈액의 RFP 양성 백혈구의 유세포 분석으로 평가된다. 이 방법을 사용하여 이식 후 4 주에 골수성 세포의 ~ 90 % 이식 및 ~ 70 %의 림프세포를 달성 할 수 있습니다. 게놈 DNA는 RFP 양성 혈액 세포로부터 분리되고, 표적 부위 DNA의 일부는 게놈 편집을 검증하기 위해 PCR에 의해 증폭된다. 이 프로토콜은 조혈-조절 유전자의 높은 처리량 평가를 제공하고 조혈 세포 침범을 가진 다양한 마우스 질환 모델로 확장될 수 있다.
Introduction
혈액학 및 면역학에 있는 많은 연구 결과는 Mx1-Cre, Vav-Cre 및 그 외와 같은 조혈 계통 특정 Cre 드라이버를 이용하는 종래의 조건부 형질전환/녹아웃 마우스를 포함하여 유전자 변형마우스의 가용성에 의존합니다 1,2,3,4,5. 이러한 전략은 시간이 많이 걸리고 재정적으로 부담이 될 수있는 새로운 마우스 균주의 설립을 필요로한다. 게놈 편집 기술의 혁명적 인 발전은 적절한 기술 전문 지식으로 3-4 개월 만에 새로운 마우스 균주의 생성을 가능하게하는 동안6,7,8,9 실험을 추구하기 전에 마우스 콜로니를 증폭하는 데 훨씬 더 많은 시간이 필요합니다. 또한 이러한 절차는 비용이 많이 듭니다. 예를 들어, 잭슨 연구소는 균주당 $16,845(2018년 12월 현재)에 녹아웃 마우스 생성 서비스의 현재 가격을 나열합니다. 따라서, 종래의 뮤린 형질전환 접근법보다 더 경제적이고 효율적인 방법이 더 유리하다.
정기적으로 간격을 두는 짧은 palindromic 반복 /CRISPR 관련 단백질 9 (CRISPR / Cas9) 기술은 신속하고 효율적인 RNA 기반, 서열 특정 게놈 편집을위한 새로운 도구의 개발을 주도하고있다. 원래 침입 병원체 DNA를 파괴하는 세균 적응 면역 메커니즘으로 발견, CRISPR / Cas9 시스템은 진핵 세포와 동물 모델에서 게놈 편집의 효과를 높이기 위해 도구로 사용되어왔다. 다양 한 접근 조혈 줄기 세포에 CRISPR/Cas9 기계를 전송 하는 데 사용 되었습니다 (즉, 전기 천 공, 핵, lipofection, 바이러스 전달, 그리고 다른 사람).
여기서, 렌티바이러스 시스템은 Cas9 발현 뮤린 조혈 줄기 세포를 효과적으로 감염시키고 가이드 RNA 발현 구조, 프로모터, 조절 서열 및 인코딩하는 유전자를 함께 포장하는 능력으로 인해 세포를 트랜스듀싱하는 데 사용된다. 형광 리포터 단백질 (즉, GFP, RFP). 이 방법을 사용하여, 마우스 조혈 줄기 세포의 생체 내 유전자 편집이 달성되었으며, 그 다음으로 조사된 마우스10에서골수의 성공적인 재구성이 이루어졌다. 본 연구에 채택된 렌티바이러스 벡터는 리포터 유전자로부터 상류에 내부 리보좀 진입 부위를 가진 공통 코어 EF1a 프로모터로부터 Cas9 및 GFP 리포터 유전자를 발현한다. 가이드 RNA 서열은 별도의 U6 프로모터로부터 발현된다. 이 시스템은 후보 클론 조혈 드라이버 유전자 Tet2 및 Dnmt3a10에서삽입 및 결실 돌연변이를 생성하는 데 사용된다. 그러나,이 방법에 의한 환전 효율은 상대적으로 낮다 (~5%-10%) 벡터 인서트(13Kbp)의 크기가 커서 변환 효율을 제한하고 생산 중 바이러스 역가를 줄입니다.
다른 연구에서는, 더 큰 바이러스 RNA 크기가 바이러스 생산 및 전염 효율 모두에 부정적인 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 예를 들어, 삽입 크기의 1kb 증가는 바이러스 생산을 ~50% 감소시키는 것으로 보고되고, 형질전환 효율은 마우스 조혈 줄기세포(11)에서50% 이상으로 감소할 것이다. 따라서, 시스템의 효율을 향상시키기 위해 바이러스 삽입물의 크기를 가능한 한 많이 줄이는 것이 유리하다.
이러한 단점은 Cas9 단백질이 구성적 또는 유도성 방식으로 발현되는 Cas9 형질전환 마우스를 채택함으로써 극복될 수 있다12. 구성CRISPR/Cas9 노크인 마우스는 유비쿼터스 방식으로 Rosa26 궤양에서 CAG 프로모터로부터 Cas9 엔도뉴클레아제 및 EGFP를 표현한다. 따라서, 코어 EF1a 프로모터의 제어 하에 U6 프로모터 및 RFP 리포터 유전자의 제어 하에 sgRNA를 이용한 컨스트럭트는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 게놈 편집을 달성할 수 있다. 이 시스템으로, 조혈 줄기 세포의 유전자는 성공적으로 편집되었습니다, ~ 90% 형질 전환 효율을 보여주는. 따라서, 이 프로토콜은 표적 유전자 돌연변이가 조혈 계통내로 도입되는 마우스를 만드는 신속하고 효과적인 방법을 제공한다. 우리의 실험실은 주로 심혈 관 질환 과정에서 클론 조혈의 역할을 연구하기 위해 기술의이 유형을 사용하는 동안13,14,15,그것은 또한 혈액학의 연구에 적용 악성16. 더욱이, 이 프로토콜은 HSPC에 있는 DNA 돌연변이가 조혈 계통에 있는 그밖 질병 또는 발달 프로세스에 어떻게 영향을 미치는지의 분석으로 확장될 수 있습니다.
견고한 렌티바이러스 벡터 시스템을 확립하기 위해서는 조혈 세포의 전염 및 이식에 대한 높은 역가 바이러스 성 주식 및 최적화된 조건이 필요합니다. 프로토콜에서, 지침은 섹션 1에서 높은 역가 바이러스 주식의 제조에 제공되며, 섹션 2에서 뮤린 조혈 줄기 세포의 배양 조건을 최적화하고, 섹션 3에서 골수 이식 방법을 평가하고, 평가합니다. 섹션 4의 접착.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 장점은 기존의 마우스 형질전환 접근법에 비해 신속하고 매우 비용 효율적인 방식으로 조혈 세포에서 특정 돌연변이를 수용하는 동물 모델을 생성한다는 것입니다. 이 방법론은 조혈 세포 유전자 조작을 가진 마우스의 생성을 1 달 안에 가능하게 한다는 것을 것을을 발견되었습니다. 이 프로토콜에는 추가 고려가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
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Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. S. 미국 심장 협회 박사 후 펠로우십 17POST33670076에 의해 지원되었다. K. W.는 NIH 보조금 R01 HL138014, R01 HL141256 및 R01 HL139819에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216– | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
References
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