Summary

Modifica del genoma mediato da Lentiviral/Cas9 per lo studio delle cellule ematopoietiche nei modelli di malattia

Published: October 03, 2019
doi:

Summary

Descritto sono protocolli per l’editing genomico altamente efficiente di cellule staminali e progenitrici (HSPC) murine (HSPC) dal sistema CRISPR/Cas9 per sviluppare rapidamente sistemi di modelli murini con modifiche genetiche specifiche del sistema ematopoietico.

Abstract

La manipolazione dei geni nelle cellule staminali ematopoietiche utilizzando approcci convenzionali di transgenesi può essere dispendiosa in termini di tempo, costi e impegnativi. Approfittando dei progressi nella tecnologia di editing del genoma e nei sistemi di erogazione transgenici mediati da lentivirus, è descritto un metodo efficiente ed economico che stabilisce topi in cui i geni vengono manipolati specificamente nelle cellule staminali ematopoietiche. I lentivirus vengono utilizzati per trasdurre le cellule del midollo osseo con un’RNA guida (gRNA) mirato a geni specifici e a un gene di segnalazione della fluorescenza rossa (RFP), quindi queste cellule vengono trapiantate in topi C57BL/6 irradiati letale. I topi trapiantati con lentivirus che esprimono gRNA non mirati vengono utilizzati come controlli. L’innesto di cellule staminali ematopoietiche trasdotte viene valutato mediante analisi citometrica del flusso di leucociti RFP positivi al sangue periferico. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere la trasduzione di cellule mieloidi e il 70% delle cellule linfoidi a 4 settimane dopo il trapianto. Il DNA genomico è isolato dalle cellule del sangue RFP-positive e parti del DNA del sito mirato sono amplificate dalla PCR per convalidare l’editing del genoma. Questo protocollo fornisce una valutazione ad alto throughput dei geni regolatori dell’ematopoiesi e può essere esteso a una varietà di modelli di malattia dei topi con coinvolgimento delle cellule ematopoietiche.

Introduction

Molti studi in ematologia e immunologia si basano sulla disponibilità di topi geneticamente modificati, tra cui topi transgenici/knock-out convenzionali e condizionali che utilizzano driver Cre specifici del sistema ematopoietico come Mx1-Cre, Vav-Cre e altri 1,2,3,4,5. Queste strategie richiedono la creazione di nuovi ceppi di topi, che possono richiedere molto tempo e gravare finanziariamente. Mentre i progressi rivoluzionari nella tecnologia di editing del genoma hanno permesso la generazione di nuovi ceppi di topi in appena 3-4 mesi con l’adeguata competenza tecnica6,7,8,9 , è necessario molto più tempo per amplificare la colonia di topi prima di condurre esperimenti. Inoltre, queste procedure sono costose. Ad esempio, Jackson Laboratory elenca il prezzo attuale dei servizi di generazione di topi knock-out a 16.845 dollari per ceppo (a partire da dicembre 2018). Pertanto, i metodi più economici ed efficienti rispetto agli approcci transgenici murini convenzionali sono più vantaggiosi.

La tecnologia CRISPR/Cas9, regolarmente interspaziata, ripete a breve ad occhiindromici/proteina CRISPR associata a ROF (CRISPR/Cas9) ha portato allo sviluppo di nuovi strumenti per un rapido ed efficiente editing del genoma basato su RNA e sequenza. Originariamente scoperto come meccanismo immunitario adattativo batterico per distruggere il DNA patogeno invasore, il sistema CRISPR/Cas9 è stato utilizzato come strumento per aumentare l’efficacia dell’editing del genoma nelle cellule eucariotiche e nei modelli animali. Sono stati adottati diversi approcci per trasmettere macchinari CRISPR/Cas9 in cellule staminali ematopoietiche (ad esempio, elettroporazione, nucleofezione, lipofezione, esodo virale e altri).

Qui, un sistema di lentivirus viene impiegato per traducire le cellule grazie alla sua capacità di infettare efficacemente le cellule staminali murine ematopoietiche di Cas9 e di confezionare insieme il costrutto guida per l’espressione dell’RNA, i promotori, le sequenze regolatorie e i geni che codificano proteine reporter fluorescenti (ad esempio, GFP, RFP). Utilizzando questo metodo, è stata ottenuta l’editing genico ex vivo delle cellule staminali ematopoietiche del topo, seguita da una ricostituzione di successo del midollo osseo in topi letali irradiati10. Il vettore lentivirus impiegato per questo studio esprime i geni dei reporter Cas9 e GFP del comune promotore di EF1a con un sito di ingresso ribosomico interno a monte del gene del reporter. La sequenza di RNA guida è espressa da un promotore U6 separato. Questo sistema viene quindi utilizzato per creare mutazioni di inserimento e delezione nei geni del driver di ematopoiesi clonale candidati Tet2 e Dnmt3a10. Tuttavia, l’efficienza della trasduzione con questo metodo è relativamente bassa (-5%-10%) a causa delle grandi dimensioni dell’inserto vettoriale (13 Kbp) che limita l’efficienza della trasduzione e riduce il titro del virus durante la produzione.

In altri studi, è stato dimostrato che la dimensione più grande dell’RNA virale influisce negativamente sia sulla produzione di virus che sull’efficienza della trasduzione. Ad esempio, un aumento di 1 kb nella dimensione dell’inserto è segnalato per ridurre la produzione di virus del 50%, e l’efficienza della trasduzione diminuirà a più del 50% nelle cellule staminali ematopoietiche del topo11. Pertanto, è vantaggioso ridurre il più possibile le dimensioni dell’inserto virale per migliorare l’efficienza del sistema.

Questa lacuna può essere superata impiegando topi transgenici Cas9, in cui la proteina Cas9 è espressa in modo flessibile o inducibile12. I topi knock-in CRISPR/Cas9 di tipo constitutivo escludano Cas9 endonuclease ed EGFP dal promotore CAG presso il locus Rosa26 in modo onnipresente. Così, un costrutto con sgRNA sotto il controllo del promotore U6 e del gene reporter RFP sotto il controllo del promotore core EF1a può essere consegnato utilizzando il vettore lentivirus per ottenere l’editing del genoma. Con questo sistema, i geni delle cellule staminali ematopoietiche sono stati modificati con successo, mostrando un’efficienza di trasduzione del 90%. Pertanto, questo protocollo fornisce un metodo rapido ed efficace per creare topi in cui nel sistema ematopoietico mirate vengono introdotte mutazioni genetiche mirate. Mentre il nostro laboratorio utilizza prevalentemente questo tipo di tecnologia per studiare il ruolo dell’ematopoiesi clonale nei processi di malattia cardiovascolare13,14,15, è applicabile anche agli studi di ematologica malignità16. Inoltre, questo protocollo può essere esteso all’analisi di come le mutazioni del DNA nell’HSPC influiscono su altri processi di malattia o di sviluppo nel sistema ematopoietico.

Per stabilire un robusto sistema vettoriale di lentivirus, sono necessari elevati titoli virali di titro e condizioni ottimizzate per la trasduzione e il trapianto di cellule ematopoietiche. Nel protocollo vengono fornite istruzioni sulla preparazione di uno stock virale ad alto titolo titer nella sezione 1, ottimizzando le condizioni di coltura delle cellule staminali ematopoietiche murine nel paragrafo 2, i metodi per il trapianto di midollo osseo nella sezione 3 e la valutazione l’innesto nella sezione 4.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) dell’Università della Virginia. 1. Generazione e purificazione delle particelle di lentivirus NOTA: Le particelle di Lentivirus contenenti la guida ottimizzata RNA possono essere prodotte dai protocolli dettagliati forniti da Addgene:

Representative Results

Utilizzando il protocollo sopra descritto, sono stati ottenuti circa 0,8-1,0 x 108 cellule del midollo osseo per topo. Il numero di cellule lignaggio-negativo che otteniamo è di circa 3 x 106 celle per mouse. Tipicamente, la resa delle cellule del lingaggio-negativo del midollo osseo è del 4%-5% di quella delle cellule nucleari totali del midollo osseo. Il chimerismo delle cellule trasdotte (RFP-positivo)…

Discussion

Il vantaggio di questo protocollo è la creazione di modelli animali che ospitano mutazioni specifiche nelle cellule ematopoietiche in modo rapido e altamente economico rispetto agli approcci transgenici murini convenzionali. Si è scoperto che questa metodologia consente la generazione di topi con manipolazioni geniche delle cellule ematopoietiche entro 1 mese. Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che richiedono ulteriore considerazione.

Screening della sequenza di gR…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S. S. è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dell’American Heart Association 17POST33670076. K. W. era supportato dalle sovvenzioni NIH R01 HL138014, R01 HL141256 e R01 HL139819.

Materials

1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE EXELINT 26028 general supply
293T cells ATCC CRL-3216– Cell line
APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) BD Biosciences 560599 Antibodies
APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) BD Biosciences 552094 Antibodies
BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml BD 309604 general supply
BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added BD Bioscience 365974 general supply
BD Precisionglide needle, 18 G BD 305195 general supply
BD Precisionglide needle, 22 G  BD 305155 general supply
BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) Biolegend 100752 Antibodies
BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) Biolegend 100349 Antibodies
Collagen from calf skin Sigma-Aldrich 9007-34-5 general supply
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well  Millipore Sigma CLS3471 general supply
CRISPR/Cas9 knock-in mice The Jackson Laboratory 028555 mouse
DietGel 76A Clear H2O 70-01-5022 general supply
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose Sigma Aldrich D6429 Medium
eBioscience 1X RBC Lysis Buffer Thermo fisher Scientific 00-4333-57 Solution
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Life Sciences 353003 general supply
Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube Life Sciences 352054 general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352098 general supply
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate  Life Science 353046 general supply
Fisherbrand microhematocrit capillary tubes Thermo Fisher Scientific 22-362566 general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm Fisher Scientific 22363548 general supply
FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) Invitrogen 11-0042-85 Antibodies
Fixation Buffer BD Bioscience 554655 Solution
Guide-it Compete sgRNA Screening Systems Clontech 632636 Kit
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein 29404 Solution
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit  Takara 631235 Kit
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-858 Kit
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm Millipore Sigma SLHV004SL general supply
PBS pH7.4 (1X) Gibco 10010023 Solution
PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) eBioscience 25-1152-82 Antibodies
PEI MAX Polysciences 24765-1 Solution
Penicillin-Streptomycin Mixture Lonza 17-602F Solution
PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Biosciences 560602 Antibodies
pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP  Addgene 57823 Plasmid
pMG2D Addgene 12259 Plasmid
Polybrene Infection/Transfection Reagent Sigma Aldrich TR-1003-G Solution
Polypropylene Centrifuge Tubes BECKMAN COULTER 326823 general supply
psPAX2  Addgene 12260 Plasmid
RadDisk – Rodent Irradiator Disk Braintree Scientific IRD-P M general supply
Recombinant Murine SCF Peprotech 250-03 Solution
Recombinant Murine TPO  Peprotech  315-14 Solution
StemSpan SFEM STEMCELL Technologies 09600 Solution
TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli Thermo fisher Scientific K457501 Kit
Zombie Aqua Fixable Viability Kit BioLegend 423102 Solution 

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Sano, S., Wang, Y., Evans, M. A., Yura, Y., Sano, M., Ogawa, H., Horitani, K., Doviak, H., Walsh, K. Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models. J. Vis. Exp. (152), e59977, doi:10.3791/59977 (2019).

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