Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme
Summary
Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.
Abstract
Konvansiyonel transgenez yaklaşımları kullanarak hematopoetik kök hücrelerde genlerin manipüle edilmesi zaman alıcı, pahalı ve zorlu olabilir. Genom düzenleme teknolojisindeki gelişmelerden ve lentivirus aracılı transgen dağıtım sistemlerinden yararlanan, genlerin özellikle hematopoetik kök hücrelerde manipüle edildiği fareleri oluşturan etkili ve ekonomik bir yöntem burada tanımlanmıştır. Lentivirüsler, Cas9-ifade eden soyu negatif kemik iliği hücrelerini belirli genleri ve kırmızı floresan muhabiri geni (RFP) hedefleyen bir kılavuz RNA (gRNA) ile nakletmek için kullanılır, daha sonra bu hücreler ölümcül ışınlanmış C57BL/6 farelere nakledilir. Mercekleyici olmayan gRNA’yı ifade eden lentivirus ile nakledilen fareler kontrol olarak kullanılır. Transekte hematopoetik kök hücrelerin engreftlemesi periferik kanın RFP-pozitif lökositlerinin akış sitometrik analizi ile değerlendirilir. Bu yöntemle transplantasyondan 4 hafta sonra miyeloid hücrelerin ~%90 transdüksiyonu ve lenfoid hücrelerin ~%70’i elde edilebilir. Genomik DNA RFP-pozitif kan hücrelerinden izole edilir ve hedeflenen alan DNA’sının bazı bölümleri genom düzenlemesini doğrulamak için PCR tarafından yükseltilir. Bu protokol hematopoyonis düzenleyici genlerin yüksek iş bölümü değerlendirmesini sağlar ve hematopoetik hücre tutulumu olan çeşitli fare hastalığı modellerine genişletilebilir.
Introduction
Hematoloji ve immünoloji deki birçok çalışma, Mx1-Cre, Vav-Cre ve diğerleri gibi hematopoetik sisteme özgü Cre sürücülerini kullanan konvansiyonel ve koşullu transgenik/nakavt fareler de dahil olmak üzere genetiği değiştirilmiş farelerin bulunabilirliğine dayanır. 1,2,3,4,5. Bu stratejiler, zaman alıcı ve mali açıdan yük oluşturabilecek yeni fare suşlarının kurulmasını gerektirir. Genom düzenleme teknolojisindeki devrim niteliğindeki gelişmeler, uygun teknik uzmanlık6,7,8,9 ile 3-4 ay gibi az bir sürede yeni fare suşlarının oluşmasını sağlarken , deneyler takip edilmeden önce fare kolonisini güçlendirmek için çok daha fazla zaman gereklidir. Buna ek olarak, bu yordamlar pahalıya mal olur. Örneğin Jackson Laboratory, nakavt fare üretim hizmetlerinin geçerli fiyatını suuş başına 16.845 ABD doları olarak listelemaktadır (Aralık 2018 itibariyle). Böylece geleneksel murine transgenik yaklaşımlara göre daha ekonomik ve verimli yöntemler daha avantajlıdır.
Kümelenmiş düzenli olarak uzaya açık kısa palindromik tekrarlar/CRISPR ilişkili protein 9 (CRISPR/Cas9) teknolojisi, hızlı ve verimli RNA tabanlı, diziye özgü genom düzenlemesi için yeni araçların geliştirilmesine yol açmıştır. Başlangıçta istilacı patojen DNA yok etmek için bir bakteriyel adaptif bağışıklık mekanizması olarak keşfedilen, CRISPR / Cas9 sistemi ökaryotik hücreler ve hayvan modellerinde genom düzenleme etkinliğini artırmak için bir araç olarak kullanılmıştır. CRISPR/Cas9 makinelerinin hematopoetik kök hücrelere (elektroporasyon, nükleofection, lipofection, viral doğum ve diğerleri) iletilmesi için bir dizi yaklaşım kullanılmıştır.
Burada, cas9 ifade eden murine hematopoetik kök hücreleri etkili bir şekilde bulaştırabilme ve rna ifade yapısını, organizatörleri, düzenleyici dizileri ve kodlayan genleri bir araya getirebilme yeteneği nden dolayı hücreleri nakletmek için bir lentivirus sistemi kullanılmaktadır. floresan muhabir proteinler (yani, GFP, RFP). Bu yöntemle fare hematopoetik kök hücrelerinin ex vivo gen düzenlemesi sağlanmış, ardından ölümcül ışınlanmış farelerde kemik iliğin başarılı bir şekilde yeniden yapılandırılması10. Bu çalışma için kullanılan lentivirus vektörü, ortak çekirdek EF1a promotöründen Cas9 ve GFP muhabiri genlerini, muhabir geninden yukarı doğru bir iç ribozomal giriş alanı ile ifade eder. Kılavuz RNA dizisi ayrı bir U6 organizatöründen ifade edilir. Bu sistem daha sonra aday klonal hematopoiesis sürücü genleri Tet2 ve Dnmt3a10ekleme ve silme mutasyonları oluşturmak için kullanılır. Ancak, bu yöntemle transdüksiyon verimliliği nispeten düşüktür (~%5-%10) transdüksiyon verimliliğini sınırlayan ve üretim sırasında virüs titreğini azaltan vektör kesici ucun (13 Kbp) büyük boyutu nedeniyle.
Diğer çalışmalarda, daha büyük viral RNA boyutunun hem virüs üretimini hem de transdüksiyon verimliliğini olumsuz etkilediği gösterilmiştir. Örneğin, kesici uç boyutunda 1 kb’lik bir artışın virüs üretimini ~%50 oranında azalttığı ve fare hematopoetik kök hücrelerinde transdüksiyon verimliliğinin %50’den fazla azalacağı bildirilmiştir11. Böylece, mümkün olduğunca sistemin verimliliğini artırmak için viral eklemek boyutunu azaltmak için avantajlıdır.
Bu eksiklik Cas9 transgenik fareler istihdam ile aşılabilir, hangi Cas9 proteini ya bir kurucu veya indüklenebilir şekilde ifade edilir12. Kurucu CRISPR /Cas9 knock-in fareler cas9 enonuklezaz ve EGFP Rosa26 locus de CAG organizatörü her yerde bir şekilde ifade eder. Böylece, çekirdek EF1a organizatörü kontrolü altında U6 organizatörü ve RFP muhabiri gen kontrolü altında sgRNA ile bir yapı genom düzenleme elde etmek için lentivirus vektör kullanılarak teslim edilebilir. Bu sistemle hematopoetik kök hücrelerin genleri başarılı bir şekilde düzenlendi ve ~%90 transdüksiyon verimi gösterdi. Böylece bu protokol, hedeflenen gen mutasyonlarının hematopoetik sisteme girdiği farelerin yaratılması için hızlı ve etkili bir yöntem sağlamaktadır. Laboratuvarımız ağırlıklı olarak kardiyovasküler hastalık süreçlerinde klonal hematopoyis rolünü incelemek için bu tür teknolojiyi kullanırken13,14,15, aynı zamanda hematolojik çalışmalar için de geçerlidir malignite16. Ayrıca, bu protokol, HSPC’deki DNA mutasyonlarının hematopoetik sistemdeki diğer hastalıkları veya gelişimsel süreçleri nasıl etkilediğinin analizine kadar genişletilebilir.
Sağlam bir lentivirus vektör sistemi kurmak için, hematopoetik hücrelerin transdüksiyonve nakli için yüksek titre viral stoklar ve optimize edilmiş koşullar gereklidir. Protokolde, bölüm 1’de yüksek bir titreviral stoğun hazırlanması, bölüm 2’de murine hematopoetik kök hücrelerin kültür koşullarının optimize edilebisi, bölüm 3’te kemik iliği nakli için yöntemler ve bölüm 4’te engraftment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün avantajı, geleneksel fare transgenik yaklaşımlarına kıyasla hematopoetik hücrelerde spesifik mutasyonları barındıran hayvan modellerinin hızlı ve yüksek maliyetli bir şekilde oluşturulmasıdır. Bu metodolojinin 1 ay içinde hematopoetik hücre gen manipülasyonu yapan farelerin oluşumunu sağladığı bulunmuştur. Bu protokolde daha fazla dikkate alınması gereken birkaç kritik adım vardır.
gRNA dizisinin taranması
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. S. bir Amerikan Kalp Derneği doktora sonrası burs 17POST33670076 tarafından desteklendi. K. W. NIH hiber01 HL138014, R01 HL141256 ve R01 HL139819 tarafından desteklendi.
Materials
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216– | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
References
- Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
- Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
- Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
- Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9 (312), (2016).
- Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
- Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
- Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
- Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
- Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
- Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. , (2018).
