Lentiviral CRISPR/Cas9-mediert Genova redigering for studier av blodkreft celler i sykdom modeller
Summary
Beskrevet er protokoller for svært effektiv Genova redigering av murine blodkreft stem og stamceller (HSPC) av CRISPR/Cas9 system for å raskt utvikle musemodell systemer med blodkreft system-spesifikke gen modifikasjoner.
Abstract
Manipulere gener i blodkreft stamceller ved hjelp av konvensjonelle transgenesis tilnærminger kan være tidkrevende, dyrt og utfordrende. Drar nytte av fremskritt i Genova redigering teknologi og lentivirus-mediert transgene levering systemer, en effektiv og økonomisk metode er beskrevet her som etablerer mus der gener er manipulert spesielt i blodkreft stamceller. Lentiviruses brukes til å overfører Cas9-uttrykker avstamning-negative benmargceller med en guide RNA (gRNA) rettet mot spesifikke gener og et rødt fluorescens reporter gen (RFP), da disse cellene er transplantert inn drepende-bestrålt C57BL/6 mus. Mus transplantert med lentivirus uttrykker ikke-mål gRNA brukes som kontroller. Engraftment av transduced blodkreft stamceller er evaluert av flyt analytiske analyse av RFP-positive leukocytter av perifert blod. Ved hjelp av denne metoden, ~ 90% Transduction av myelogen celler og ~ 70% av lymfoide celler på 4 uker etter transplantasjon kan oppnås. Genomisk DNA er isolert fra RFP-positive blodlegemer, og deler av målrettede området DNA forsterkes av PCR å validere Genova redigering. Denne protokollen gir en høy-gjennomstrømming evaluering av hematopoiesen-regulatoriske gener og kan utvides til en rekke mus sykdom modeller med blodkreft celle engasjement.
Introduction
Mange studier i hematologi og immunologi stole på tilgjengeligheten av genmodifiserte mus, inkludert konvensjonelle og betingede transgene/Knock-Out mus som utnytter blodkreft system-spesifikke grobunn drivere som Mx1-grobunn, VAV-grobunn, og andre 1,2,3,4,5. Disse strategiene krever etablering av nye mus stammer, som kan være tidkrevende og økonomisk belaste. Mens revolusjonerende fremskritt i Genova redigering teknologi har aktivert generering av nye mus stammer i så få som 3-4 måneder med riktig teknisk ekspertise6,7,8,9 , mye mer tid er nødvendig for å forsterke musen kolonien før eksperimenter er forfulgt. I tillegg er disse prosedyrene kostbare. For eksempel, Jackson Laboratory lister gjeldende pris på Knock-Out mus generasjon tjenester på $16 845 per stamme (pr. desember 2018). Derfor er metoder som er mer økonomiske og effektive enn konvensjonelle murine transgene tilnærminger, mer fordelaktige.
Gruppert regelmessig oppdelt korte palindromic gjentar/CRISPR assosiert protein 9 (CRISPR/Cas9) teknologi har ført til utvikling av nye verktøy for rask og effektiv RNA-baserte, sekvens-spesifikke Genova redigering. Opprinnelig oppdaget som en bakteriell adaptive uimottakelig mekanisme for å ødelegge invaderende patogen DNA, har CRISPR/Cas9 systemet blitt brukt som et verktøy for å øke effektiviteten av Genova redigering i eukaryote celler og dyremodeller. En rekke tilnærminger har vært ansatt for å overføre CRISPR/Cas9 maskiner i blodkreft stamceller (dvs. electroporation, nucleofection, lipofection, viral levering, og andre).
Her er en lentivirus system ansatt for å overfører celler på grunn av sin evne til å effektivt infisere Cas9-uttrykker murine blodkreft stamceller og pakke sammen guiden RNA uttrykket konstruere, arrangører, regulatoriske sekvenser, og gener som koder fluorescerende reporter proteiner (dvs. GFP, RFP). Ved hjelp av denne metoden, ex vivo genredigering av mus blodkreft stamceller har blitt oppnådd, etterfulgt av vellykket rekonstituering av benmarg i drepende bestrålt mus10. Den lentivirus vektoren ansatt for denne studien uttrykker Cas9 og GFP reporter gener fra felles kjernen EF1a promoter med en intern ribosomal oppføring side oppstrøms fra reporteren genet. Guiden RNA sekvensen uttrykkes fra en egen U6 promoter. Dette systemet brukes deretter til å lage innsetting og sletting mutasjoner i kandidaten klonal hematopoiesen driver gener Tet2 og Dnmt3a10. Men Transduction effektiviteten ved denne metoden er relativt lav (~ 5%-10%) på grunn av den store størrelsen på vektoren sette inn (13 KBP) som begrenser Transduction effektivitet og reduserer virus titer under produksjon.
I andre studier har det vist seg at større viral RNA-størrelse negativt påvirker både virus produksjon og Transduction effektivitet. For eksempel, en 1 kb økning i sett inn størrelse rapporteres å redusere virus produksjonen med ~ 50%, og Transduction effektivitet reduseres til mer enn 50% i mus blodkreft stamceller11. Dermed er det en fordel å redusere størrelsen på viral sette inn så mye som mulig for å forbedre effektiviteten av systemet.
Dette brist kan overvinnes ved å ansette Cas9 transgene mus, der Cas9 proteinet er uttrykt i enten en konstituerende eller induserbart måte12. De konstituerende CRISPR/Cas9 knock-in mus uttrykker Cas9 endonuclease og EGFP fra CAG arrangøren på Rosa26 geometriske i en allestedsnærværende måte. Dermed en konstruere med sgRNA under kontroll av U6 promoter og RFP reporter genet under kontroll av kjernen EF1a arrangøren kan leveres ved hjelp av lentivirus vektor å oppnå Genova redigering. Med dette systemet, har gener av blodkreft stamceller blitt redigert, viser en ~ 90% Transduction effektivitet. Dermed gir denne protokollen en rask og effektiv metode for å lage mus der målrettede genmutasjoner er innført i blodkreft systemet. Mens vår Lab er overveiende bruker denne type teknologi for å studere rollen til klonal hematopoiesen i kardiovaskulær sykdom prosesser13,14,15, det er også aktuelt for studier av hematologiske kreft16. Videre kan denne protokollen utvides til analyse av hvordan DNA mutasjoner i HSPC påvirke andre sykdom eller utviklingsmessige prosesser i blodkreft systemet.
Å etablere en robust lentivirus vektor system, høy titer viral aksjer og optimaliserte betingelser for Transduction og transplantasjon av blodkreft celler er nødvendig. I protokollen, instruksjonene er gitt på utarbeidelse av en høy titer viral lager i § 1, optimalisere kultur forholdene i murine blodkreft stamceller i § 2, metoder for benmarg transplantasjon i § 3, og vurdere engraftment i avsnitt 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fordelen med denne protokollen er etableringen av dyremodeller harboring spesifikke mutasjoner i blodkreft celler i en rask og svært kostnadseffektiv måte sammenlignet med konvensjonelle mus transgene tilnærminger. Det ble funnet at denne metodikken gjør det mulig generering av mus med blodkreft celle gen-manipulasjoner innen 1 måned. Det er flere kritiske trinn i denne protokollen som krever ytterligere vurdering.
Screening av gRNA sekvens
Det…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. S. ble støttet av en American Heart Association postdoktor Fellowship 17POST33670076. K. W. ble støttet av NIH tilskudd R01 HL138014, R01 HL141256, og R01 HL139819.
Materials
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216– | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
References
- Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
- Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
- Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
- Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9 (312), (2016).
- Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
- Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
- Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
- Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
- Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
- Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. , (2018).
