ग्लूकोज में आईएनकेटी कोशिकाओं की दत्तक इम्यूनोथेरेपी-6-फॉस्फेट Isomerase (G6PI)-प्रेरित आरए चूहों
Summary
यह प्रोटोकॉल G6PI मिश्रित पेप्टाइड्स का उपयोग करता है ताकि गठिया मॉडल का निर्माण किया जा सकता है जो सीडी 4+ टी कोशिकाओं और साइटोकिन्स में मानव रूमेटॉयड गठिया के करीब हैं। विशिष्ट फेनोटाइप और कार्यों के साथ उच्च शुद्धता इनवेरिएंट प्राकृतिक हत्यारा टी कोशिकाएं (मुख्य रूप से iNKT2) को वेवो इंडक्शन और इन विट्रो शुद्धि में दत्तक इम्यूनोथेरेपी के लिए प्राप्त किया गया था।
Abstract
रुमेटी गठिया (आरए) एक जटिल पुरानी भड़काऊ ऑटोइम्यून बीमारी है। रोग का रोगजनन इनवेरिएंट नेचुरल किलर टी (आईएनकेटी) कोशिकाओं से संबंधित है। सक्रिय आरए वाले रोगी कम iNKT कोशिकाओं, दोषपूर्ण सेल समारोह, और Th1 के अत्यधिक ध्रुवीकरण पेश करते हैं। इस अध्ययन में, एक आरए पशु मॉडल hGPI325-339 और hGPI469-483 पेप्टाइड्स के मिश्रण का उपयोग कर स्थापित किया गया था । आईएनकेटी कोशिकाओं को वीवो इंडक्शन और इन विट्रो शुद्धि में प्राप्त किया गया था, जिसके बाद दत्तक इम्यूनोथेरेपी के लिए आरए चूहों में जलसेक किया गया था। इन वीवो इमेजिंग सिस्टम (आईवीआईएस) ट्रैकिंग से पता चला कि आईएनकेटी कोशिकाओं को मुख्य रूप से तिल्ली और जिगर में वितरित किया गया था। सेल थेरेपी के बाद 12 दिन पर, रोग प्रगति काफी धीमा हो गई, नैदानिक लक्षणों को कम किया गया, थाइमस में आईएनकेटी कोशिकाओं की बहुतायत में वृद्धि हुई, थाइमस में iNKT1 का अनुपात कम हो गया, और टीएनएफ-α, IFN-, और आईएल-6 के स्तर में सीरम कम हो गया। आईएनकेटी कोशिकाओं की दत्तक इम्यूनोथेरेपी ने प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संतुलन को बहाल किया और शरीर की अत्यधिक सूजन को ठीक किया।
Introduction
रुमेटी गठिया (आरए) एक ऑटोइम्यून रोग है जो 0.5-1% घटना1,2के साथ पुरानी, प्रगतिशील आक्रामकता की विशेषता है। अंतर्निहित रोगजनन को ऑटोरेएक्टिव सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं के असामान्य प्रसार के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, जो सीडी 4+आईएफएन-+ और सीडी4 + आईएल-17ए +टी कोशिकाओं के अनुपात में वृद्धि से प्रकट होता है, और सीडी 4+आईएल-4+ और सीडी4 +सीडी 25 + FoxP3 +टी कोशिकाओं की कम संख्या। इसलिए, भड़काऊ साइटोकिन्स का स्राव बढ़ जाता है, और अत्यधिक भड़काऊ प्रतिक्रिया शरीर की प्रतिरक्षा प्रणाली के देशी संतुलन और सहिष्णुता कार्य को नष्ट कर देती है। इसके अलावा, सहायक टी लिंफोसाइट (Th) 1 कोशिकाएं जो संयुक्त में प्रवेश करती हैं, भड़काऊ प्रतिक्रिया और संयुक्त क्षति को बढ़ाती हैं। इसलिए, अत्यधिक भड़काऊ प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षा सहिष्णुता और प्रतिरक्षा संतुलन की बहाली का अवरोध आरए3,4के उपचार के लिए महत्वपूर्ण है।
आईएनकेटी कोशिकाओं में एनके सेल और टी सेल कार्य और विशेषताएं दोनों हैं। आईएनकेटी कोशिकाएं सीमित टीसीआर-चेन प्रदर्शनों के साथ एक अलग, इनवैरिएंट टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) α-चेन को आश्रय देते हैंऔर एंटीजन-पेश कोशिकाओं की सतह पर प्रमुख हिस्टोकॉम्पिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) वर्ग I अणु सीडी1डी द्वारा प्रस्तुत ग्लाइकोलिपिड एंटीजन को पहचानते हैं। मित्सुओ एट अल6 ने आरए सहित कई ऑटोइम्यून रोगों में बड़ी संख्या में आईएनकेटी कोशिकाओं और कार्यात्मक दोषों का पता लगाया। ऑरयोर एट अल7 ने दिखादिया कि आईएनकेटी कोशिकाओं का ऑटोइम्यून सहिष्णुता बनाए रखने पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है और जब आईएनकेटी कोशिकाओं की संख्या और कार्य बहाल हो जाता है, तो बीमारी को समाप्त कर दिया जाता है। इसके अलावा, Miellot-Gafsou एट अल8. पाया कि iNKT कोशिकाओं ने न केवल रोग को निरस्त किया बल्कि बीमारी की प्रगति को भी बढ़ाया। इन विरोधाभासी परिणामों से पता चलता है कि iNKT कोशिकाएं विषम टी कोशिकाएं हैं, और विभिन्न सबसेट के कार्य को उलट दिया जा सकता है। आरए के नैदानिक अध्ययन में, आईएनकेटी कोशिकाओं की आवृत्ति रोग गतिविधि9के स्कोर से सहसंबद्ध है। परिणामों ने यह भी पुष्टि की कि आरए रोगियों में आईएनकेटी की आवृत्ति में कमी आई, सीडी4+आईएफएन-+ टी सेल सबसेट की संख्या में वृद्धि हुई, और भड़काऊ साइटोकिन्स आईएफएन-एऔर टीएनएफ-α के गुप्त स्तरमें 10, 11की वृद्धि हुई। इसके अलावा शरीफ एट अल12 ने टाइप 1 डायबिटीज (T1D) की जांच की और पाया कि आईएनकेटी कोशिकाओं के चयनात्मक अर्क ने भड़काऊ साइटोकिन आईएल-4 की अभिव्यक्ति को बढ़ादिया, प्रतिरक्षा सहिष्णुता बनाए रखी, और टाइप 1 मधुमेह के विकास को रोका । इसलिए, विशिष्ट iNKT कोशिकाओं के दत्तक जलसेक या iNKT कोशिकाओं के लक्षित सक्रियण आरए रोगियों में iNKT कोशिकाओं के स्तर को बढ़ाता है, जो आरए उपचार में एक सफलता हो सकती है।
सेलुलर इम्यूनोथेरेपी वर्तमान में बहुत रुचि है और व्यापक रूप से कैंसर चिकित्सा में इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, आईएनकेटी कोशिकाएं दुर्लभ, विषम इम्यूनोरेगुलेटरी कोशिकाएं (पीबीएमसी की कुल संख्या का केवल 0.3%)13हैं, जो संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों को सीमित करती हैं। इन कोशिकाओं को मुख्य रूप से तीन उपआबादी में विभाजित किया गया है: 1) iNKT1 कोशिकाओं, जो प्रोमायलोसाइटिक ल्यूकेमिया जिंक-फिंगर प्रोटीन (PLZF) और टी बॉक्स प्रतिलेखन कारक (टी-बेट) की एक उच्च अभिव्यक्ति है; 2) पीएलजेडएफ और गेटा बाध्यकारी प्रोटीन 3 (GATA3) की मध्यवर्ती अभिव्यक्ति के साथ iNKT2 कोशिकाएं; 3) PLZF और रेटिनोइड से संबंधित अनाथ परमाणु रिसेप्टर (ROR) की कम अभिव्यक्ति के साथ iNKT17 कोशिकाओं– सक्रिय iNKT कोशिकाओं Th1, Th2, और Th17 की तरह साइटोकिन्स, जो iNKT कोशिकाओं15के विभिन्न इम्यूनोमोडुलेटरी प्रभाव निर्धारित स्राव । आईएनकेटी कोशिकाओं की विभिन्न उपआबादी की विशिष्ट सक्रियता के इम्यूनोमोडुलेटरी और इम्यूनोथेरप्यूटिक प्रभाव अलग-अलग हैं। इसलिए, शरीर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने के लिए विरोधी भड़काऊ कार्यों के साथ आईएनकेटी कोशिकाओं (मुख्य रूप से iNKT2) के विशिष्ट फेनोटाइप का चयन आरए में प्रतिरक्षा असंतुलन और प्रतिरक्षा विकारों को सही कर सकता है।
आरए रोगजनन के उपचार और अध्ययन के लिए एक आदर्श पशु मॉडल की स्थापना का बहुत महत्व है। वर्तमान में, सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले और परिपक्व पशु मॉडलों में कोलेजन-प्रेरित गठिया, अडजूवांगठिया, ज़िमोसन-प्रेरित गठिया, और पॉलीसैकराइड-प्रेरित गठिया16–17शामिल हैं। हालांकि, ऐसा कोई मॉडल नहीं है जो मानव आरए की सभी विशेषताओं को पूरी तरह से अनुकरण कर सके। टाइप II कोलेजन-प्रेरित गठिया (सीआईए) एक क्लासिक गठिया मॉडल है। सीआईए टाइप II कोलेजन-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ चूहों के प्रतिरक्षण से प्रेरित है, जो इस रोग मॉडल की एंटीबॉडी निर्भरता को दर्शाती है। बेनूर्स एट अल ग्लूकोज-6-फॉस्फेट आइसोमरसे (G6PI) के लिए एक प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ एक मॉडल का वर्णन किया है, जो अतिसंवेदनशील माउस उपभेदों में परिधीय सममित पॉलीआर्थराइटिस लाती है18,19। इस मॉडल में गठिया का विकास टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और जन्मजात प्रतिरक्षा18,19,20पर निर्भर करता है। होरिकोशी21 ने पाया कि जी6पीआई पॉलीपेप्टाइड टुकड़ों के साथ डीबीए/1 चूहों के प्रतिरक्षण के परिणामस्वरूप आरए मॉडल सीआईए मॉडल की तुलना में सीडी4+ टी कोशिकाओं और साइटोकिन्स (यानी आईएल-6 और टीएनएफ-α) के संदर्भ में मानव आरए के समान हैं । टीसीआर मान्यता स्थल पर उत्तेजक प्रभाव को बढ़ाने के लिए, जी6पीआई (hGPI325-339 और hGPI469-483) के मिश्रित पॉलीपेप्टाइड टुकड़ों का उपयोग आरए माउस मॉडल के निर्माण के लिए डीबीए/1 चूहों को प्रतिरक्षित करने के लिए किया गया था। इस दृष्टिकोण की सफलता दर अधिक हो सकती है क्योंकि hGPI325-339 और hGPI469-483 I-A क्यू-प्रतिबंधित टी सेल प्रतिक्रियाओं के लिए इम्यूनोप्रमुख हैं। इसलिए, यह मॉडल22आरए रोगियों में सीडी 4+ टी कोशिकाओं और आईएनकेटी सेल दोषों के प्रसार का अनुकरण कर सकता है। आरए इम्यूनोपैथोलॉजी के बुनियादी शोध ने हमारी आगे गहराई से जांच की नींव रखी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
आईएनकेटी कोशिकाएं विशेष टी कोशिकाएं हैं जो जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा को पाटती हैं और मुख्य रूप से सीडी 4+++/सीडी8+ थाइमोसाइट्स से विकसित की जाती हैं। आईएनकेटी कोशिकाओं में विविध इम्यूनोरेग?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हमारे अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी) (81771755), हेबेई प्रांत (ZD2017009) के कॉलेजों और विश्वविद्यालय के विज्ञान और प्रौद्योगिकी प्रमुख अनुसंधान परियोजना और हेबेई विश्वविद्यालय के मेडिकल प्रयोग केंद्र की पशु प्रयोगशाला द्वारा समर्थित किया गया था। हम उनके समर्थन के लिए आभारी हैं ।
Materials
| Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF | BD | 563490 | America |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-048-801 | Germany |
| Columns | Miltenyi | MS | Germany |
| Cryogenic Centrifuge | Beckman | Allegra® X-15R | America |
| DiR | Thermo Fisher Scientific | D12731 | America |
| Embedding Center | Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. | BMJ-1 | China |
| FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain | BD | 553170 | America |
| Flow cytometer | BD | Accuri C6 | America |
| Freund's complete adjuvant | Sigma | F5881 | America |
| hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) | Karebay Biochem | 18062202 | China |
| hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) | Karebay Biochem | 18062203 | China |
| In Vivo Imaging System | PerkinElmer | caliper IVIS lumina II | America |
| Ionomycin Calcium | Cayman | 10004974 | America |
| KRN7000 | AdipoGen | AG-CN2-0013 | America |
| Mouse CD1d Tetramer-PE | MBL | TS-MCD-1 | Japan |
| Mouse percoll | Solarbio | P8620 | China |
| Optical Microscope | Olympus | Olympus-II | Japan |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt | BD | 562683 | America |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet | BD | 561316 | America |
| Pertussis toxin | Sigma | P7208 | America |
| phorbol esters | Cayman | 10008014 | America |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BD | 555899 | America |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | Israel |
| Th1/Th2/Th17 cytokines kit | BD | 560485 | America |
| Ultramicrotome | Leica | Leica EM UC6 | Germany |
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